RESUMO O Melocactus conoideus é uma espécie listada como criticamente ameaçada de extinção, o que evidencia a necessidade de ações de pesquisa que contribuam para a sua proteção. No entanto, são poucos os estudos acerca da espécie em diversos aspectos, sobretudo os embasados em informações genéticas com o uso de marcadores moleculares. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar o perfil de segmentos de DNA amplificados e selecionar primers Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) visando subsidiar análises genéticas em M. conoideus. Quatro genótipos da espécie foram utilizados para a análise molecular com 23 primers ISSR. Foram observadas 118 marcas (40,7% polimórficas) com média de 7,87 marcadores por iniciador. Com base no padrão de geração de marcas, 15 primers se mostraram adequados, exibindo de 4 a 11 marcadores com boa qualidade de visualização. A heterozigosidade esperada e o Conteúdo de Informação Polimórfica também foram estimados, exibindo valores médios de 0,43 e 0,33, respectivamente. Estes marcadores possuem potencial uso em estudos moleculares em M. conoideus incluindo estimativas de variabilidade e estruturação genética visando conhecer a base genética da espécie e auxiliar no manejo para a conservação. PALAVRAS-CHAVE: Cabeça-De-Frade; Espécie Criticamente Ameaçada; Marcadores Moleculares.