A produção de β-lactamases por bactérias Gram-negativas é a principal forma de resistência aos antimicrobianos, com destaque para as β-lactamases de amplo espectro (ESBL) e de carbapenemases (KPC). Como forma de controle dos microrganismos multirresistentes, os metabólitos secundários vegetais são objeto de estudo para o desenvolvimento de novos medicamentos. O óleo essencial de Melaleuca alternifolia (OTT) possui efeito antifúngico, anti-inflamatório e antimicrobiano, este último atribuído principalmente aos terpenos presentes na sua composição. Este trabalho objetivou determinar o potencial antimicrobiano de emulsões de OTT frente a isolados de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae multirresistentes produtores de ESBL e carbapenemases responsáveis por infecções hospitalares. A atividade antibacteriana das emulsões do óleo essencial foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), pelos métodos de macrodiluição em tubos, Spot-on-the-lawn, difusão por poços em ágar e disco-difusão. As concentrações que inibiram o crescimento bacteriano variaram entre 0,25% a 1,5% para as diferentes metodologias aplicadas. As emulsões do óleo essencial de Melaleuca alternifolia inibiram o crescimento das bactérias multirresistentes, conforme observado no método da macrodiluição em tubo e Spot-on-the-lawn. A cepa hospitalar de Escherichia coli produtora de ESBL mostrou-se a cepa mais sensível, o que permite descrever o potencial antibacteriano do óleo, que deverá ser avaliado em estudos futuros como agente de controle.