O Brasil tem como um dos pilares de sua economia o agronegócio, representando cerca de 21.4% do Produto Interno Bruto (PIB) no ano de 2019, segundo relatório do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. O rebanho de bovinos leiteiros confere um papel fundamental tanto economicamente, com um valor bruto de produção de 33 bilhões de reais anuais, quanto ambientalmente, pois gera grandes quantidades de dejetos que são fonte de contaminação e proliferação de microrganismos patógenos, podendo ocasionar problemas de saúde pública e poluição ambiental. Diante deste problema, a digestão anaeróbia configura-se como uma possível solução para as questões levantadas, capaz inclusive de produzir subprodutos economicamente vantajosos, o biogás e o biofertilizante. Existem diversas reivindicações acerca da reintrodução do biofertilizante na lavoura e uma delas refere-se à quantidade mínima permitida de coliformes termotolerantes, os quais são relacionados à contaminação fecal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi identificar o potencial de redução de microrganismos termotolerantes ao longo do processo de biodigestão anaeróbia de efluentes da pecuária bovina leiteira, em dois tratamentos, com e sem inoculação, utilizando informações de banco de dados referente à extração de DNA da microbiota destes locais. O resultado obtido no grupo com inóculo foi de 100% de redução de organismos termotolerantes, ao passo que no grupo sem adição do digestato foi percebido uma redução de 80%. Com o presente estudo, corrobora-se a hipótese de que o inóculo apresenta um papel determinante para a diminuição dos microrganismos termotolerantes durante a digestão anaeróbia de dejetos animais de produção.