Hampir sebanyak 90% industri farmasi di Indonesia masih menggunakan bahan baku impor. Indonesia memiliki salah satu bahan baku yang cukup melimpah yaitu selulosa. Bacterial nanocellulose (BNC) adalah hasil sintesis dari bakteri aerobic seperti bakteri asam asetat Gluconacetobacter spp. yang berbentuk selulosa murni dengan diameter berukuran nano. Bahan baku BNC yang digunakan dalam industri farmasi adalah BNC dalam bentuk slurry atau high viscose nanocellulose. Tujuan penelitian ini adalah untuk memilih bakteri dan kondisi optimum dalam memproduksi BNC. Bakteri yang digunakan adalah Gluconacetobacter xylinus dan Gluconacetobacter intermedius yang berasal dari InaCC-LIPI dan Gluconacetobacter sp. dari industri nata de coco. Inokulum dari ketiga jenis kultur bakteri tersebut dikultivasi selama 7 hari dalam medium Hestrin&Schramm (HS) cair menggunakan kultur statis dan agitasi dengan kecepatan pengadukan 150 rpm pada pH 5 dan suhu 25 ºC. Isolat bakteri Gluconacetobacter sp. dipilih sebagai bakteri penghasil BNC karena memiliki nilai yield paling tinggi. Kemudian isolat tersebut ditumbuhkan pada variasi kecepatan agitasi (100, 150, dan 200 rpm), variasi pH (4,0; 4,5; 5,0; dan 6,0), dan variasi suhu (25-30 ºC). Penelitian ini menunjukkan bahwa Gluconacetobacter sp. memiliki kondisi optimum pada kecepatan agitasi 150 rpm, pH 5,5, dan suhu 27 ºC. Optimization of Bacterial Nanocellulose Production in Agitation Culture MethodsAbstractAlmost 90% of pharmaceutical industry in Indonesia still uses imported raw material. However, Indonesia has one of the abundant raw materials which is cellulose. Bacterial nanocellulose (BNC) is a pure form of nanocellulose biopolymer material synthesized by microbes such as acetic acid bacteria of Gluconacetobacter spp. as pure cellulose and having diameter in nano scale. BNC used in pharmaceutical industry is in the slurry form/high viscose nanocellulose. The purpose of this study is to determine the bacteria and the optimum conditions to produce BNC. The bacteria used were Gluconacetobacter xylinus and Gluconacetobacter intermedius from InaCC-LIPI and Gluconacetobacter sp. from nata industry. The inoculums were cultivated for 7 days in liquid Hestrin & Schramm (HS) medium using static and agitation culture with a stirring speed of 150 rpm at pH 5 and temperature 25 ºC. The production of BNC has been conducted by using Gluconacetobacter sp., because it has the highest yield. Then it was inoculated at different variation of agitation speed (100, 150, and 200 rpm), pH (4.0; 4.5; 5.0; and 6.0), and temperature (25-30 ºC). This research shows that Gluconacetobacter sp. has optimum conditions at the agitation speed of 150 rpm, pH 5.5, and temperature 27 ºC.Keywords: Bacterial nanocellulose, Gluconacetobacter, agitation