O principal fator a limitar o processo de criopreservação de sêmen equino está relacionado à própria espécie, por apresentar uma grande variabilidade nas características dos ejaculados pós-descongelação. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a viabilidade espermática pós-descongelação, do sêmen de garanhões das raças Quarto de Milha e Mangalarga Marchador utilizando-se dois diluentes (Tris e Botu-crio®) na criopreservação. Para tanto, foram analisadas as características físicas do sêmen fresco, funcionalidade da membrana espermática pelo Teste Hiposmótico (HOST), motilidade total e vigor pelo Teste de Termoresistência (TTR), motilidade progressiva pelo sistema computadorizado CASA (Computer Assisted Sêmen Anlyses) e integridade da membrana espermática, do acrossoma e funcionalidade de mitocôndria por microscopia de epifluorescência. O diluente Botu-crio® preservou melhor os valores de motilidade e vigor e a integridade de membrana plasmática, pós-descongelamento. Não houve diferença significativa entre as raças quanto à motilidade total e vigor no sêmen fresco, bem como para a análise desses parâmetros no Teste de Termoresistência pós-descongelamento. Garanhões da raça Quarto de Milha apresentaram percentual maior de defeitos maiores na análise de patologia espermática.