Los ecosistemas dulceacuícolas son una fuente primaria de servicios ecosistémicos indispensables para el sostenimiento de la vida y albergan una importante diversidad de insectos acuáticos. Dados los vacíos de información sobre la entomofauna acuática en parques nacionales, el objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad de insectos acuáticos del Parque Nacional Natural Selva de Florencia (PNNSF), ubicado en el noroccidente colombiano. Se recolectaron macroinvertebrados acuáticos en tres microcuencas seleccionadas del parque (La Selva, Las Mercedes y Chupaderos). Los especímenes fueron identificados y depositados en la Colección Entomológica del Programa de Biología de la Universidad de Caldas (CEBUC) y, posteriormente, se analizó su composición, riqueza y diversidad. Se recolectaron 534 individuos  representados en 10 órdenes, 41 géneros y 57 morfoespecies. Todos los géneros reportados constituyen nuevos registros en el PNNSF y cuatro de las especies de Ephemeroptera son nuevas, y de estas tres aún están en  proceso de descripción. La mayor riqueza y diversidad se encontraron en la quebrada La Selva, con 20 taxonesexclusivos, entre ellos, Dryops, Gyretes, Anchytarsus, Diochus, Limnocoris, Hebrus y Thraulodes,según el análisis de composición. Este estudio constituye el primer levantamiento taxonómico de macroinvertebrados acuáticos del PNNSF. Los nuevos registros y especies documentados demuestran la importancia de ampliar la investigación sobre la entomofauna acuática en la zona para así facilitar futuros estudios ecológicos (incluidos programas de  biomonitoreo), sistemáticos y biogeográficos en la región.