Las especies de peces en Colombia están sujetas a procesos de sobrepesca, introducción de especies exóticas, deterioro de hábitat y fragmentación de ecosistemas, con la consecuente pérdida de conectividad que limita el flujo genético y pudiera llevar a las poblaciones a la extinción. En el presente trabajo se analizó la estructura genética poblacional de Brycon henni, un pez de importancia económica y ecológica, en cuatro cuencas de la región Andina colombiana, mediante el uso de diez marcadores microsatélites en 60 muestras de los ríos Risaralda (RR), Campoalegre (RC), Riofrío (RRf) y Chinchiná (RCh). Se encontró un total de 136 alelos. Con excepción del marcador BoM12, todos fueron altamente informativos y polimórficos y en todos se presentó desviación significativa (P < 0.05) del equilibrio Hardy Weinberg. En RC se observó el mayor número de alelos (81), Número promedio de alelos (8) y alelos privados (34), además una HE de 0.689 ± 0.05. En general, hubo un marcado déficit de heterocigotos con respecto a la población total (FIT = 0.562), dentro de las subpoblaciones (FIS = 0.526) y moderada, pero altamente significativa estructura genética (FST = 0.07). Según la distancia estándar de Nei, la población más divergente fue la del RC con un k = 4, se encontró tendencia a cuatro poblaciones ancestrales. Los resultados sugieren que el flujo genético entre poblaciones naturales de B. henni es limitado, lo cual puede tener efectos negativos sobre su conservación. Los resultados sugieren que las poblaciones pueden estar alcanzando valores críticos de baja densidad, lo cual pone en riesgo su conservación.