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Introducción: En la actualidad hay un incremento de los delitos sexuales en el país, y muchos quedan en la impunidad porque no han sido reportados o lo hacen de manera tardía, ya que las víctimas tienen temor a denunciar el hecho para no ser revictimizadas durante el proceso legal. El trabajo pericial en biología forense inicia con la toma de muestra de la víctima y el análisis de muestras biológicas, se centra en la investigación de semen o líquido espermático, que se pudieran haber dejado tanto en la víctima como en el lugar del hecho, y se continua con la búsqueda microscópica para visualizar espermatozoides utilizando la tinción específica "Christmas Tree o árbol de navidad". Metodología: El propósito de la investigación fue validar las tinciones Diff Quick, Gram, Panóptico y Papanicolau como técnicas alternativas para la identificación de espermatozoides y su posible aplicación en la investigación forense. El diseño fue experimental ya que se manipulan intencionalmente los parámetros de prueba y compara las tinciones descritas con la prueba Gold Standard Christmas Tree. Las muestras de líquido seminal pertenecen a pacientes voluntarios que acuden al Hospital General San Juan Riobamba, en el periodo septiembre – octubre 2022. Resultados: Los resultados estuvieron en función de la calidad de imagen microscópica que permitieron establecer las ventajas y desventajas de cada una de las pruebas. Se encontró diferencia estadística significativa entre la sensibilidad de las pruebas experimentales (p-valor < 0,05). Las tinciones Diff Quick y Panóptico mostraron mayor sensibilidad en la identificación de espermatozoides, en estas tinciones además se observa un mayor tamaño de la cabeza del espermatozoide y mostraron un fondo extendido ligeramente sucio en comparación con las demás tinciones. Conclusiones: Las pruebas experimentales evidencian mayor sensibilidad en las tinciones Diff Quick y Panóptico, pero Gram y Papanicolau podrían usarse con este propósito porque se alcanza buena definición morfológica de los espermatozoides.  Área de estudio general: Criminalística. Área de estudio específica: Biología Forense.