Introducción: La resistencia bacteriana de los bacilos Gram negativos tiene un importante impacto económico y social en salud pública. Ha incrementado la morbilidad y la mortalidad en los últimos años, conllevando incremento de costos en salud; es un hecho significativo que orienta la implementación de acciones de prevención y estudio, mediante la identificación de los perfiles regionales como estrategia de vigilancia y contención de la resistencia. Objetivo: Caracterizar fenotípicamente la resistencia en cepas de bacilos Gram negativos aislados de infecciones, en un centro hospitalario de segundo nivel en el departamento de Boyacá, Colombia. Métodos: Se hizo un estudio descriptivo de corte transversal. La identificación bacteriana y las pruebas de sensibilidad se determinaron mediante el método automatizado VITEK®. Los fenotipos de resistencia a β-lactamasas de espectro extendido y carbapenemasas, se confirmaron siguiendo la metodología del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Resultados: Se procesaron 458 cultivos durante cuatro meses, de los cuales 298 fueron negativos y 160 mostraron aislamientos bacterianos positivos; 127 eran procedentes de urocultivo. El patógeno prevalente fue Escherichia coli. De las cepas de estudio, se confirmó el fenotipo β-lactamasa en 11 aislamientos y uno para el fenotipo β-lactamasa/carbapenemasa. Conclusiones: Los hallazgos del presente estudio evidencian que E. coli es el microorganismo predominante a partir de los aislamientos que presentan un fenotipo multirresistente. La identificación de este tipo de cepas bacterianas, que son una amenaza en el ambiente hospitalario y el comunitario, amerita un cambio en las estrategias de contención de la multirresistencia; igualmente, los resultados identifican el panorama epidemiológico regional. Palabras clave: farmacorresistencia bacteriana, infecciones bacterianas, betalactamasas, salud pública.