Media pertumbuhan yang mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh bakteri dan yang sering digunakan untuk pertumbuhan bakteri yaitu media Nutrient Agar. Mahalnya harga media pertumbuhan bakteri mendorong para peneliti untuk menggunakan media pertumbuhan bakteri yang terbuat dari bahan-bahan alami yang mudah didapatkan dan tidak mengeluarkan biaya yang mahal. Ikan tongkol memiliki kandungan protein sebesar 26,46% dan ikan lele yang mempunyai kandungan protein sebesar 24,63%. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif bersel satu, bersifat patogen dan dapat menyebabkan penyakit diare. Jenis penelitian yang dilakukan adalah Eksperimen. Hasil penelitian ini menunjukkan jumlah rata-rata koloni terbanyak pada pertumbuhan Escherichia coli dengan menggunakan media alternatif Ikan Tongkol yaitu pada variasi massa 5 gram yaitu 118 x 10-13 CFU/mL, sedangkan jumlah rata-rata koloni terbanyak pada pertumbuhan Escherichia coli dengan menggunakan media alternatif Ikan Lele yaitu pada variasi massa 5 gram yaitu 104 x 10-13 CFU/mL. Media substitusi Nutrient Agar dari tepung daging Ikan Tongkol dan Ikan Lele dengan variasi massa 1 gram, 3 gram dan 5 gram dapat menumbuhkan koloni bakteri Escherichia coli dengan jumlah dan karakteristik yang berbeda. Hal tersebut disebabkan oleh kandungan protein di dalam tepung daging Ikan Tongkol dan Ikan Lele yang dapat memenuhi kebutuhan nutrisi pertumbuhan Escherichia coli. Ikan tongkol dan ikan lele mempunyai potensi sebagai bahan dasar pembuatan media alternatif untuk pertumbuhan bakteri Escherichia coli ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media alternatif ikan tongkol dan ikan lele. Kata Kunci : Ikan Tongkol, Ikan Lele, Nutrient Agar, Escherichia coli