O processo de conservação de sêmen sob resfriamento necessita de adição de diluentes, contendo diferentes formulações. Estudos com adição de gema de ovo ao diluente apresentam resultados divergentes quanto a qualidade espermática, durante a conservação e criopreservação em diferentes espécies de mamíferos. Diante disso, o objetivo deste experimento foi avaliar a qualidade espermática de sêmen canino adicionado de diluente a base de leite e gema de ovo de galinha a 2%, mantido sob resfriamento a 5ºC por 72h. Para isso, 20 ejaculados foram coletados de caninos e submetidos a dois tratamentos: 1) Diluente Sem Gema e 2) Diluente Com Gema de ovo de galinha a 2%. As amostras foram mantidas em geladeira a 5ºC e avaliadas as 24, 48 e 72h de resfriamento quanto a motilidade, vigor, integridade de membrana plasmática e morfologia. A análise estatística incluiu estatística descritiva, Shapiro–Wilk, Wilcoxon, análise de variância (ANOVA), comparação de médias pelo teste de Tukey. Os valores foram expressos em a média ± erro padrão da média. Foi verificada diferença significativa entre os tratamentos quanto à motilidade às 48h (Sem Gema 38,3±4,2% e Com Gema 51,5±4,7%) e 72h (Sem Gema 30±4,8% e Com Gema 38,4±5,1%) (p<0,05). O vigor, a integridade funcional da membrana plasmática e a morfologia espermática não foram significativamente afetados pelo tratamento. Em conclusão, os ejaculados de caninos adicionados de diluente acrescido de gema de ovo de galinha a 2% apresentaram maior percentual de motilidade durante resfriamento a 5ºC por 72h.