Spodoptera frugiperda es un insecto considerado plaga primaria del cultivo de maíz y secundaria en arroz, algodón, sorgo y pastizales. Presenta dos biotipos (maíz y arroz) casi idénticos morfológicamente, pero difieren en su composición genética, resistencia hacia insecticidas y Bacillus thuringiensis, siendo el biotipo de maíz más resistente respecto al biotipo de arroz. Este trabajo es la primera identificación molecular en Colombia de estos biotipos a partir de larvas recolectadas en cultivos de maíz, arroz y algodón en el departamento del Tolima, con el uso de una PCR-RFLP a nivel del gen mitocondrial citocromo oxidasa I para identificar al biotipo de maíz, y una PCR de la región tandem FR del ADN nuclear para identificar biotipo de arroz. Los resultados diferenciaron tres poblaciones de S. frugiperda: a) biotipo de maíz, compuesto por individuos que generaron digestiones con la enzima MspI del gen COI, b) biotipo de arroz compuesto por individuos que generaron amplificaciones de peso moleculares mayores a 500 pb con el marcador FR, y finalmente c) un grupo de individuos clasificados como “híbridos” entre estos dos marcadores, producto del cruce entre hembras del biotipo de maíz y machos del biotipo de arroz y viceversa. Los individuos genotipificados como biotipo de maíz se recolectaron en cultivos de maíz y algodón exclusivamente y los individuos genotipificados como biotipo de arroz en cultivos de arroz principalmente y en bajas proporciones en cultivos de maíz y algodón.