Hospital-acquired infections (HAIs) merupakan infeksi yang terjadi pada pasien saat menerima perawatan di rumah sakit dalam waktu lebih dari 48 jam. Sebagian besar HAIs disebabkan oleh bakteri yang resisten terhadap antibiotik. Salah satu penyebabnya adalah bakteri Bacillus cereus. B. cereus memiliki dua jenis toksin yang menyebabkan gejala gastrointestinal. Pada individu immunocompromised, B. cereus dapat menyebabkan sejumlah infeksi sistemik dan lokal fatal. Upaya untuk mengurangi resistensi bakteri adalah dengan mengurangi penggunaan antibiotik yang tidak rasional, salah satunya dengan menggunakan alternatif pengobatan herbal. Daun jeruk purut (Citrus hystrix D.C) mengandung flavonoid, alkaloid, tannin, kuinon, dan terpenoid yang terbukti memiliki efek antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk purut terhadap B. cereus secara in vitro. Dalam penelitian ini digunakan 7 perlakuan yaitu konsentrasi 3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; 100%; 0% sebagai kontrol negatif, dan antibiotik kloramfenikol 10 mg/mL sebagai kontrol positif. Pengulangan sebanyak empat kali menggunakan metode difusi sumuran. Hasil menunjukkan rata-rata terbentuknya diameter zona hambat pertumbuhan pada konsentrasi 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; 100% berturut-turut 5,93 mm; 7,05 mm; 8,23 mm; 10,41 mm; 12,00 mm. Uji post hoc Tukey HSD menunjukkan ekstrak mulai efektif sebagai antibakteri terhadap B. cereus pada konsentrasi 6,25% (p < 0,05). Uji korelasi Pearson menunjukkan adanya hubungan signifikan antara konsentrasi ekstrak terhadap zona hambat pertumbuhan (p < 0,05). Disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun jeruk purut efektif sebagai antibakteri B. cereus secara in vitro dan signifikan bila dibandingkan dengan kloramfenikol. Kata kunci: antibakteri, Bacillus cereus, daun jeruk purut (Citrus hystrix D.C).