Cymodocea rotundata  merupakan salah satu jenis lamun yang berpotensi sebagai antibakteri. Senyawa bioaktif yang bersifat sebagai antibakteri adalah fenol, flavonoid dan tanin. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui perbedaan lama inkubasi dan konsentrasi ekstrak lamun C. rotundata yang berbeda terhadap aktivitas antibakteri S. aureus dan E. Coli. Metode penelitian yang digunakan yaitu experimental laboratories dengan menggunakan rancangan dasar penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan pola faktorial, pola terbagi oleh faktor lama inkubasi bakteri (24 jam, 48 jam dan 72 jam) dan perbedaan konsentrasi ekstrak lamun (5%, 10% dan 15%). Data dianalisis menggunakan SIDIK RAGAM dan dilakukan analisis lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ), apabila terdapat perbedaan pada perlakuan. Ekstrak lamun C. rotundata efektif sebagai antibakteri dengan kategori sedang yaitu zona hambat berkisar antara 5-10 mm. Konsentrasi optimum untuk menghambat S.aureus dan E.coli adalah 15% dengan lama inkubasi 48 jam dengan zona hambat yang dihasilkan masing-masing sebesar 6, 123 mm. Dan 5, 833 mm.Cymodocea rotundata is a type of seagrass that has a potential as an antibacterial. Bioactive compounds which act as such as antibacterial phenols, flavonoids and tannins. The purpose of this study was to determine the effect of different concentration and time of incubation  of seagrass C.rotundata as antibacterial against  S. aureus and E. coli. The method used was experimental laboratories using the basic design of the study completely randomized design (CRD) with factorial pattern (2 factor). The first factor were different concentration (5%, 10% and 15% ) and second factor were time of incubations (24 hours, 48 hours and 72 hours). Data were analyzed using ANOVA and conducted a further test Honestly Significant Difference (HSD), if treatment gave significant effect. C. rotundata extracts had antibacterial activity with medium category which inhibition zone ranges from 5-10 mm. The optimum concentration for inhibiting S. aureus and e. coli were 15% with incubation time of 48 hours resulting inhibition zone 6,123 mm and 5,833 respectively.