Objetivos: Conhecer as dúvidas dos profissionais da saúde sobre biossegurança no Centro de Materiais e Esterilização (CME) e refletir sobre as respostas emitidas. Método: Estudo exploratório descritivo qualitativo. O cenário da pesquisa foi um site nacional reconhecido que dispõe uma lista de discussão por e-mail. O corpus foram 2.260 mensagens enviadas à lista de discussão em 2014; a amostra foi composta por 109 mensagens com conteúdo relacionado à biossegurança no CME. Utilizou-se para interpretação dos dados a Análise de Conteúdo de Bardin. Resultados: Na análise emergiram quatro categorias temáticas das dúvidas mais frequentes denominadas: soluções; equipamentos e materiais; Legislação; e validação do processo. Evidenciou-se forte relação entre CME e Controle de Infecção Hospitalar (CIH), tanto nos questionamentos quanto nas respostas. Conclusão: A maioria dos profissionais que encaminharam dúvidas foram enfermeiros. As dúvidas mais frequentes sobre biossegurança relacionavam-se a soluções usadas, equipamentos e materiais. As respostas foram fundamentadas na legislação vigente e emitidas por profissionais com experiência. Palavras-chave: Segurança de equipamentos médicos. Enfermagem. Material.