Hidrolisat protein ikan (HPI) dihasilkan dari proses penguraian protein ikan menjadi peptida sederhana maupun asam amino melalui proses hidrolisis oleh enzim, asam, atau basa. Enzim yang digunakan adalah enzim protease, baik yang berasal dari tanaman, hewan maupun mikroba. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh penambahan enzim papain terhadap karakteristik HPI dan menentukan optimum terbaik hidrolisat protein dari jenis ikan yang berbeda dengan penambahan enzim papain. Metode penelitian ini adalah experimental laboratories dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Perlakuan yang diterapkan adalah perbedaan jenis ikan yang meliputi ikan nila, ikan bandeng, dan ikan cucut. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam ANOVA dengan uji lanjut untuk menentukan nilai yang berpengaruh maupun tidak dengan uji BNJ (Beda Nyata Jujur). Hasil penelitian dari ketiga perlakuan didapatkan HPI terbaik yaitu rendemen HPI nila 5,64% dengan kadar protein 30,17%, kadar air 9,06%, dan viskositas 1,91 cP sedangkan profil asam amino terbanyak adalah asam glutamat terutama pada HPI ikan cucut sebesar 4,183%. Fish protein hydrolysate (FPH) is produced from the decomposition of fish protein become peptides and amino acids through hydrolysis by enzymes, acids or bases. The enzyme used are protease enzymes, both derived from plants, animals, and microbes. The purpose of this study was to determine the effect of papain enzyme addition on FPH characteristics and to determine the characteristics of the FPH and determine the best optimum of FPH from different fish species with the addition of the papain enzyme. This research method is experimental laboratories by using a Completely Randomized Design (CRD). The applied treatments applied are different fish species including tilapia, milkfish, and shark. The data obtained were analyzed by using ANOVA with further test to determine the value that influencd or not with BNJ test. The results of the research from the three treatments are yield FPH tilapia 5,64% with protein content 30,17%, water content 9,06%, and viscosity 1,91 cP, while the highest amino acid profile is glutamic acid, especially in FPH shark 4,183%.