Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh tingkat keasaman media dan suhu penyimpanan terhadap pertumbuhan jamur Beauveria bassiana dan efektivitasnya dalam mengendalikan hama Spodoptera litura. Kegiatan penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus – Desember 2022 di Laboratorium Terpadu Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro), Junrejo, Batu. Penelitian dilakukan dengan 3 tahap. Tahap pertama yaitu uji selektivitas dengan parameter pengamatan pertumbuhan diameter menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap Faktorial pada tingkat keasaman media 5,5; 7; dan 8 serta suhu penyimpanan 24°C; 28°C; dan 32°C. Tahap kedua yaitu uji tingkat keasaman media dan suhu penyimpanan terpilih dengan parameter pengamatan kerapatan dan viabilitas konidia. Tahap ketiga yaitu uji efektivitas jamur B. bassiana terhadap larva S. litura dengan parameter pengamatan mortalitas dan gejala kematian larva. Tahap kedua dan ketiga menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap. Analisis data menggunakan Anova dan uji lanjut BNT pada taraf 5%. Hasil penelitian menunjukkan tingkat keasaman media dan suhu penyimpanan yang sesuai untuk pertumbuhan jamur B. bassiana adalah pada pH 5,5 dan suhu 28°C, dimana pertumbuhan diameter sebesar 8,77 cm dan kerapatan konidia sebesar 2,47×108 konidia/ml. Efektivitas jamur B. bassiana dalam mengendalikan larva S. litura mencapai 76,67% dengan gejala kematian berupa perubahan warna dan pertumbuhan hifa pada tubuh larva.