Mastitis menjadi salah satu penyakit yang menyebabkan penurunan produksi ternak dan sulit disembuhkan dengan menggunakan antibiotik dan dapat menimbulkan residu, serta memicu resistensi antibiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bakteri Gram positif yang dapat menjadi penyebab mastitis pada sapi. Penelitian menggunakan sampel yang diambil dari peternakan rakyat dengan cara swab ambing ternak. Isolasi bakteri dilakukan dengan cara penanaman pada media Mannitol Salt Agar (MSA) dan melakukan Identifikasi dengan pewarnaan Gram, Uji Katalase dan Uji biokimia (maltosa dan laktosa). Data dianalisis menggunakan analisis deskriptif yaitu jenis-jenis bakteri sebagai agen penyebab mastitis. Hasil penelitian yang didapatkan sebagai bakteri penyebab mastitis spesies Staphylococcus aureus dan Micrococcus sp. yang tergolong pada bakteri Gram positif. Dapat disimpulkan bahwa pada sapi terindikasi mastitis terdapat bakteri Gram positif, hal tersebut secara morfologi diidentifikasi yaitu Staphylococcus aureus dan Micrococcus.