341 in Vitro Maturation and in Vitro Fertilization of Alpaca (Vicugna Pacos) Oocytes: Effect of Time of Incubation on Nuclear Maturation and Cleavage

Abstract

Experiments were carried out to evaluate the effect of incubation time on nuclear maturation (Experiment 1) and determine the cleavage rate of alpaca oocytes after of IVF time (Experiment 2) In Experiment 1, CCOs were collected from slaughterhouse ovaries and transported to the laboratory in a thermos flask containing a saline solution 0.9% with antibiotic antimycotic at 35°C. CCOs were aspirated from follicles >2 mm and pooled in a conical tube to sedimentation previous to evaluation under stereomicroscope and CCOs with a cytoplasm homogeneous and 2 or more layers of cumulus cells were transferred to plates with a 40-μL drop of maturation medium TCM-199 supplemented with 10% FCS (v : v) plus 0.5 μg mL-1 FSH, 10 μg mL-1 hCG, 0.2 mM sodium pyruvate, 50 μg mL-1 gentamicine, and 1 μg mL-1 Estradiol under mineral oil with 10-12 oocytes/drop. Oocytes were incubated under the following maturation times: 30, 34, and 38 h at 39°C in an atmosphere of 5% CO2 and high humidity. After each maturation time, CCOs were removed from maturation medium and washed with PBS supplemented with 10% FCS and 1 mgmL-1 of hyaluronidase and fixed in ethanol: acetic acid (3 : 1). Oocytes were placed on the slide with minimum medium and stained with 1% orcein for 5 min The slides were examined under a phase contrast microscope at × 400 to evaluate status of nuclear maturation and classified as germinal vesicle (GV); metaphase I (M-I), anaphase-telophase; metaphase II (M-II) and degenerated. Experiment 2: The same maturation method as Experiment 1 was used. Testes were collected of mature males from slaughterhouse and transported to the laboratory. Caudal epididymide was isolated. A prick was made on the convoluted tubules with a sterile hypodermic needle and the fluid, rich in spermatozoa, was aspirated in syringes containing 2 mL of Tris-fructose egg yolk extender. Motile spermatozoa were obtained by centrifugation: 700 g on a Percoll discontinuous gradient (22.5 :45.0%) for 25 min. The supernatant was removed by aspiration and pellet (containing viable spermatozoa) was resuspended in TL stock. Spermatozoa and oocytes were co-incubated for 18-20 h at 39°C with 5% CO2 and then cultivated in TCM-199 supplemented with 10% FCS (v: v), 0.2 mM sodium pyruvate, and 50 μg mL-1 gentamicine and evaluated at 48 h. Data were subjected to ANOVA. For Experiment 1, the proportions of oocytes reaching M-II stage was 18.9 ± 15.7, 42.9 ± 16.2, and 65.8 ± 8.1% for the 30, 34, and 38 h of culture, respectively, with difference to maturation time (P < 0.05). For Experiment 2, the cleavage rate was 9.5, 7.7, and 15.4% to 30, 34, and 38 h after of fertilization time 48 h culture. These results indicate that 38 or more h is required for the maturation and fertilization of alpaca oocytes. Grant 064 FINCyT-PIBAP 2008.

PRODUCCIÓN Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES in vitro EN CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS: NUEVAS OPORTUNIDADES Y DESAFIOS

“…Por otro lado, en la MIV de ovocitos de alpaca se han utilizado diferentes tiempos tales como: 24-26 horas (Ratto et al, 2007;Mendoza et al, 2008;Huamán et al, 2011), 27 horas (Ruiz y Correa 2007) y 30 horas (Gamarra et al, 2008). Sin embargo, Huanca et al (2009), indican que son necesarias más de 38 horas para la MIV y Santayana et al (2012), realizaron un estudio con el objetivo de determinar el tiempo óptimo (24, 28 y 32 horas) de maduración nuclear in vitro de ovocitos de alpaca y evaluar la influencia de este sobre el desarrollo embrionario luego de la FIV. Los resultados obtenidos muestran que el mayor porcentaje de maduración nuclear (ovocitos en Metafase II) fue alcanzado a las 32 horas de cultivo in vitro con un 65,1%, seguido por el de 28 horas con un 50,3% y finalmente el de 24 horas con un 46,3%.…”

“…Concluyendo que el tiempo óptimo para la maduración nuclear y la adquisición máxima de la capacidad de desarrollo embrionario in vitro de ovocitos de alpaca, fue de 32 horas. Los reportes de Huanca et al (2009) y Santayana et al (2012 indicarían que en alpacas a mayor tiempo de MIV se obtienen mayores tasas de embriones. Sin embargo, en recientes estudios (Landeo et al, 2016b) han encontrado una mayor tasa de maduración de ovocitos de alpaca a las 42 horas, comparado con 26, 30, 34 y 38 horas, resultados que concuerdan en parte con los reportes de Huanca et al (2009) y Santayana et al (2012).…”

“…Los reportes de Huanca et al (2009) y Santayana et al (2012 indicarían que en alpacas a mayor tiempo de MIV se obtienen mayores tasas de embriones. Sin embargo, en recientes estudios (Landeo et al, 2016b) han encontrado una mayor tasa de maduración de ovocitos de alpaca a las 42 horas, comparado con 26, 30, 34 y 38 horas, resultados que concuerdan en parte con los reportes de Huanca et al (2009) y Santayana et al (2012). Sin embargo, cuando fecundaron los COCs con los mismos tiempos de MIV se obtuvo una mayor tasa de blastocistos a las 26 horas y una menor tasa a las 42 horas de MIV, esto parece razonable porque a las 42 horas los ovocitos que llegaron a metafase II tempranamente ya están envejecidos y cuando se los fertiliza a las 42 horas se obtiene menos desarrollo in vitro y por lo tanto menos blastocistos.…”

“…Por otro lado, con la finalidad de incrementar las tasas de desarrollo embrionario se han explorado medios de cultivo de embriones como: SOFaa (Gamarra et al, 2008), TCM 199 (Huanca et al, 2009), KSOM+SOF (Huanca et al, 2010;Condori et al, 2010) y SOFaa DMEM F12 (Trasorras et al, 2012). Sin embargo, los reportes de desarrollo embrionario han sido muy variables, Huanca et al (2009) obtuvieron desarrollos hasta dos células; Ratto et al, (2007) Landeo et al (2017a) realizaron un estudio en nuestro laboratorio con el objetivo de identificar el medio adecuado para cultivar embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro. Ovocitos de alpaca se seleccionaron y colocaron en medio de maduración por 26 horas y luego fueron colocados en FERT-TALP e inseminados con espermatozoides epididimarios que fueron recuperados en SPERM-TALP y capacitados durante 50 minutos en FERT-TALP mediante la técnica de SWIM UP.…”

Factores que afectan el desarrollo de la fecundación in vitro en camélidos

“…La producción in vitro de embriones demanda una gran cantidad de ovocitos capaces de ser fertilizados, los cuales se pueden obtener a partir de ovarios provenientes de mataderos o de animales vivos. Los dos métodos de obtención de ovocitos a partir de ovarios de mataderos utilizados en CSA son: disección de los folículos (alpacas: Del Campo et al, 1994) y aspiración de los folículos con aguja y jeringa (alpacas: Huanca et al, 2009;llamas: Del Campo et al, 1992;Ratto et al, 2005). La obtención de gametas provenientes de animales vivos ofrece la posibilidad de producir embriones de animales genéticamente superiores.…”