A Population of Thermostable Reverse Transcriptases Evolved from Thermus aquaticus DNA Polymerase I by Phage Display

Abstract

) wurde nicht kommerziell erhältliche Kaninchen-Globin-mRNA (R1253, Sigma) als Templat genutzt, sondern es wurde ein einziger Klon isoliert, und die entsprechende DNA wurde in einen pIVEX-Vektor für die In-vitro-Transkription des Kaninchen-a-Globin-Gens in mRNA (V00875, NCBI) inseriert. Das neue Genauigkeitsassay mit dieser in vitro transkribierten mRNA lieferte keine hohe Sequenzdiversität an den Positionen 29, 48 und 49 der a-Kette von Kaninchen-Globin. Daher resultierte die ursprünglich beobachtete Sequenzdiversität an diesen Positionen wahrscheinlich nicht aus polymeraseinduzierten Hotspot-Mutationen während der reversen Transkription in vitro, sondern aus dem Vorliegen unterschiedlicher mRNA-Isoformen in R1253, die weder den Produktspezifikationen zu entnehmen waren (Sigma), noch auf Nucleotidebene (in der NCBI-Sequenzdatenbank) beschrieben worden sind. Diese Isoformen sind aber auf der Aminosäureebene bekannt.[1]Deswegen müssen die beschriebenen Substitutionsgeschwindigkeiten revidiert werden. Die natürlichen DNA-Polymerasen und ihre Varianten haben hçhere Genauigkeiten als zuvor geschätzt. Die folgenden beiden Sätze sollten die entsprechenden Sätze auf S. 6281 (rechte Spalte, vorletzter Absatz) in der Originalpublikation ersetzen: "The substitution rates per base for RNA-dependent DNA polymerization of the most active variants, 5 (3.0 10 À4 ) and 14 (1.3 10 À3 ), were found to be similar or higher than that of avian myeloblastosis virus (AMV) RT (2.2 10 À4 ), which was used as a standard. Interestingly, the most abundant variant 21 (9.2 10 À5 ) had a fidelity which was about 2.5-times higher than that of AMV-RT." Die Schlussfolgerungen im letzten Absatz der Zuschrift bleiben aber unverändert, insbesondere die Beobachtung, dass die Katalyseeffizienz von DNA-Polymerasen mithilfe von gerichteter Evolution von Enzymen durch In-vitro-Selektion und Phagendisplay um mehrere Grçßenordnungen verbessert werden kann.

Evolving a Thermostable DNA Polymerase That Amplifies from Highly Damaged Templates

“…Interestingly, by employing a directed evolutionary approach, Jestin et al. have recently identified the same mutation in combination with an additional mutation to enable the respective enzyme (M747K, E742K) to use RNA as a template for DNA synthesis 5d. These findings justify further investigation of the involvement of this position in enzyme function.…”

Gerichtete Evolution einer thermostabilen DNA‐Polymerase zur Amplifikation ausgehend von stark geschädigten Templaten

“…Interessanterweise fanden Jestin et al. kürzlich durch gerichtete Evolution die gleiche Mutation in Kombination mit einer weiteren Mutation (M747K, E742K) 5d. Das betreffende Enzym erkennt RNA als Templat für die DNA‐Synthese.…”

Reverse Transcriptases: From Discovery and Applications to Xenobiology

“…Vichier‐Guerre and colleagues placed their focus on the improvement of the reverse transcription activity by retaining the thermal stability of the engineered enzyme [37] . They conducted directed evolution of the Stoffel fragment (SF) and identified two interesting variants with three amino acid substitutions, respectively.…”