A Real-Time ITS1-PCR Based Method in the Diagnosis and Species Identification of Leishmania Parasite from Human and Dog Clinical Samples in Turkey

Abstract

Human visceral leishmaniasis (VL) caused by L. infantum and cutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. tropica and L. infantum have been reported in Turkey. L. infantum is also responsible for canine leishmaniasis (CanL) and it is widely common in the country. The main aim of the present study was to design a real-time PCR method based on the internal transcribed spacer 1 (ITS1) region in the diagnosis of all clinical forms of leishmaniasis in Mediterranean, and to identify the species directly from clinical samples. Totally, 315 clinical specimens, human/canine visceral (blood, bone marrow, lymph node) and cutaneous (lesion aspiration) samples, and 51 Turkish Leishmania isolates typed by isoenzymatic method were included in the study. For optimization, DNA samples of the 34 strains were amplified by conventional ITS1-PCR and then sequenced for designing the primers and probes, allowing the species identification. Following the validation with the isolates, the test was applied on clinical samples and melting temperatures were used for genotyping. A group of PCR products were further sequenced for confirmation and assigning the inter- and intraspecies heterogeneity. The diagnosis of leishmaniasis is successfully achieved by the new real-time PCR method, and the test identified 80.43% of human and canine VL samples as L.infantum and 6.52% as L.tropica; 52.46% of CL samples as L. infantum and 26.90% as L. tropica. In 13.04% of visceral and 20.62% of cutaneous samples, two peaks were observed. Hovewer, the higher peak was found to be concordant with the sequencing results in 96.96%, in terms of species identification. The real-time ITS1 PCR assay clearly identified the leishmanial species in 81.58% of all clinical samples. Genotypic variations of Leishmania parasites in Turkey within species and intraspecies were observed, and L. tropica is also found as causative agent of human and canine VL in Turkey.

An Alternative Biphasic Nutrient Medium for the Diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis

“…Bu amaçla, Leishmania parazitlerinin SSU-rRNA ve 5.8S rRNA'sını kodlayan genleri ayıran ITS1 (Ribozomal Internal Transcribed Spacer 1) bölgesini hedefl eyen primerler (F: 5'-GCCGATCGACGTTGTAG-3' ve R: 5'-GGAAGCCAAGTCATCCAT-3'), LightCyclerFastStart DNA Master karışımı (Lifescience, Roche, ABD) ile birlikte, özgün problar kullanılarak (Probe 1: LC Red 640-ACCGAAACGCCGTCTATTTTTTTG-Phosphate; Probe 2: CCTCTCTCTCCCTCCCGCCAA-Fluorescein) çoğaltıldı [10][11][12] (Resim 1-C).…”

Determination the Role of Rhipicephalus sanguineus for Transmission of Leishmania major to Reservoir Animals

“…Leishmaniasis, zorunlu hücre içi protozoon olan Leishmania cinsindeki türlerin neden olduğu antroponotik ya da zoonotik karakterli ve farklı klinik belirtilerle kendini gösteren hastalıkların genel adlandırılmasıdır (1,2). Her yıl 300.000'i visseral leishmaniasis (VL), 1.000.000'u kutanöz leishmaniasis (KL) olmak üzere ortalama 1.300.000 yeni vaka ortaya çıktığı düşünülmektedir ki bunlardan sadece 600.000'i rapor edilen vakalardır (3).…”

“…Türkiye'de kutanöz leishmaniasise (KL) yol açan tür daha çok L. tropica; visseral leishmaniasise (VL) yol açan tür ise L. infantum olarak bilinmektedir (6). Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar-da KL vakalarında VL öyküsü olmaksızın L. infantum türünün izole edildiği, yine VL vakalarında KL öyküsü olmaksızın L. tropica türü-nün tespit edildiği bildirilmektedir (1,7,8). Bununla birlikte, Türki-ye'de KL'ye neden olan başlıca tür L. tropica olup, daha az sayıda L. infantum ve nadiren L. major kaynaklı olgular da tespit edilmiştir (7,9,10).…”

Gerbils, As Experimental Animals (Meriones unguiculatus): Is A Good Role Model for Leishmania major?

“…Leishmaniasis'de klinik olarak visseral, kutanöz ve mukokutanöz olmak üzere üç farklı tablo ortaya çıkmaktadır (2). Türkiye'de şimdiye kadar visseral leishmaniasis (VL), kutanöz leishmaniasis (KL) ve köpek visseral leishmaniasis (KVL) formları görülmüştür (3).…”

“…Türkiye, coğrafik olarak leishmaniasisin epidemiyolojisinde önemli olan farklı ekolojik ve klimatik özelliklere sahip bir ülkedir (4). Hastalığın seyri ile coğrafi yayılışı yanında, zoonotik/antroponotik karakterde olması nedeniyle de ayrı bir önem taşıdığına dikkat çekilmektedir (2). Türkiye'de KL'ye neden olan başlıca parazit türü Leishmania tropica olup, az sayıda L. infantum ve nadiren L. major kaynaklı olgular da tespit edilmiştir (5)(6)(7)(8).…”