Advances in non linear imaging microscopy for tissue and in-vivo biological samples characterization

Abstract

Η χρήση και η ανάπτυξη φασματοσκοπικών τεχνικών με έμφαση στις προηγμένες μικροσκοπικές μεθόδους για την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση ασθενειών όπως ο καρκίνος ή η ανάγκη για κατανόηση κάποιων από τους σημαντικότερους μηχανισμούς της Βιολογίας, όπως η γήρανση, βασιζόμενη στην παρατήρηση και την εξαγωγή πληροφοριών σε επίπεδο κυττάρου αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο με τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον. Η μη γραμμική απεικονιστική μικροσκοπία είναι ένα αξιόπιστο διαγνωστικό εργαλείο για μελέτες σε μικροσκοπικό επίπεδο, μιας και είναι μια ελάχιστα επεμβατική τεχνική με υψηλή διακριτική ικανότητα, ενώ επιπλέον παρέχει την δυνατότητα για την ταυτόχρονη λήψη εικόνων μέσω διαφορετικών μη γραμμικών σημάτων όπως: γένεσης δεύτερης και τρίτης αρμονικής (SHG/ THG) ή του πολυφωτονικά διεγειρόμενου φθορισμού (MPEF). Κατά την παρούσα διατριβή, πραγματοποιήθηκαν μελέτες που βοηθούν την περαιτέρω εξέλιξη των παραπάνω τεχνικών για τη διερεύνηση ποικίλων βιολογικών προβλημάτων. Επιπλέον, η δημιουργία νέων αλγορίθμων ανάλυσης δεδομένων και η εφαρμογή τεχνητών νευρωνικών δικτύων ανοίγουν νέους ορίζοντες στα πεδία εφαρμογής της μη γραμμικής μικροσκοπίας. Συγκεκριμένα, η πρώτη από τις παραπάνω μελέτες αφορά την εφαρμογή των νευρωνικών δικτύων σε εικόνες THG από ανθρώπινα δείγματα βιοψίας για την ακριβή διάγνωση του καρκίνου του μαστού σε υπό κυτταρικό επίπεδο. Αν και μόνο η διάγνωση αυτού του είδους καρκίνου με βάση την απεικόνιση άβαφων βιοψιών μεσώ THG, ήταν ιδιαίτερα καινοτόμος, αντιμετώπιζε ένα βασικό πρόβλημα, την ανάγκη εξειδικευμένου προσωπικού για την αξιολόγηση και τον διαχωρισμό των δειγμάτων. H THG απεικονίζει κυρίως οπτικές ανομοιογένιες, λιπίδια ή κυτταρικές μεμβράνες και η διάγνωση βασίζεται σε διάφορα χαρακτηριστικά των κυττάρων όπως ο όγκος τους η μορφολογία τους και το εκπεμπόμενο σήμα τους. Ωστόσο ο εντοπισμός των κυττάρων στις εικόνες THG είναι μια εξαιρετικά χρονοβόρα διαδικασία και απαιτεί ιδιαίτερη εμπειρία περιορίζοντας έτσι σε μεγάλο βαθμό την χρήση της συγκεκριμένης μη επεμβατικής διαγνωστικής τεχνικής. Η λύση σε αυτό το πρόβλημα δόθηκε μέσω της εφαρμογής των νευρωνικών δικτύων για την κατηγοριοποίηση των συγκεκριμένων εικόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εφαρμογή νευρωνικών δικτύων σε εικόνες THG για την διάγνωση του καρκίνου του μαστού έγινε για πρώτη φόρα και η επιτυχία της οδηγεί στην εξάλειψη της ανάγκης εξειδικευμένου προσωπικού και στην δραματική μείωση του χρόνο διάγνωσης φέρνοντας έτσι ένα βήμα πιο κοντά τη μη γραμμική μικροσκοπία σε κλινικές δοκιμές.Η δεύτερη μελέτη αφορά πάλι τη διάγνωση του καρκίνου του μαστού με βάση τις παραπάνω βιοψίες και τη μη γραμμική μικροσκοπία, όμως αυτή τη φορά το καταγραφόμενο μη γραμμικό σήμα ήταν αυτό της SHG. Οι ιστοί είναι πλούσιοι σε ίνες κολλαγόνου το οποίο είναι ικανό να εκπέμπει ισχυρά SHG σήματα. Τα τελευταία χρόνια έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες πάνω στην εξάρτηση της SHG από την εισερχόμενη πόλωση της ακτινοβολία (PSHG) και στις ποσοτικοποιημένες πληροφορίες που προκύπτουν μέσω αυτής όπως για παράδειγμα η παράμετρος ανισοτροπίας Β. Μέσω αυτής της παραμέτρου αλλά και με την εισαγωγή μιας νέας (ratio parameter) κατέστη δυνατός ο πλήρης διαχωρισμός μεταξύ όλων των καρκινικών σταδίων των υπό μελέτη βιοψιών (από καλοήθης έως και τρίτου σταδίου). Ο υπολογισμών και των δύο αυτών παραμέτρων διαρκεί λιγότερο από ένα δευτερόλεπτο για κάθε δείγμα μιας και βασίζεται στην ανάλυση Fourier των PSHG μετρήσεων. Επιπλέον, προτάθηκε ένα βιοφυσικό μοντέλο το οποίο ερμηνεύει αυτά τα αποτελέσματα με βάση τις μηχανικές τάσεις που εφαρμόζονται στις ίνες κολλαγόνου κατά τα διάφορα στάδια του καρκίνου.Στο πλαίσιο αυτής της διατριβής οι δυνατότητες της PSHG σε συνδυασμό με την ανάλυση Fourier χρησιμοποιήθηκαν και για τη μελέτη πιθανών δομικών αλλαγών στους ραβδωτούς μύες του πρότυπου οργανισμού Caenorhabditis elegans (C. elegans) κατά τη γήρανση. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας υποδεικνύουν ότι η δομή των ραβδωτών μυών του C elegans μεταβάλλεται καθώς αυξάνεται η ηλικία του δείγματος. Από όσο είναι γνωστό, είναι η πρώτη φορά που παρατηρείται διαφοροποίηση των εξαγόμενων PSHG αποτελεσμάτων μέσω ανάλυσης Fourier από μύες in-vivo καθώς αυξάνεται η ηλικία του δείγματος. Η διαφοροποίηση στηρίχτηκε στη διαφορά των φασματικών φάσεων των καταγραφόμενων PSHG σημάτων. Επιπλέον μέσω της νεοεισαχθήσας παραμέτρου ratio η συγκεκριμένη μελέτη έδειξε ότι η μέχρι τώρα συνήθης παραδοχή της κυλινδρικής συμμετρίας για το βιοφυσικό μοντέλο της PSHG υστερεί στην ικανοποιητική και ολοκληρωμένη περιγραφή των καταγραφόμενων δεδομένων σε σχέση με την τριγωνική συμμετρία, η οποία με την σειρά της, υπολείπεται συγκρινόμενη με την πιο γενική περίπτωση όπου το δείγμα δεν είναι απαραίτητο να διακατέχεται από κάποια συγκεκριμένη συμμετρία.Το τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής αφιερώθηκε στην ανάδειξη της δυνατότητας της μη γραμμικής μικροσκοπίας για εφαρμογή σε μελέτες υλικών έχοντας ως στόχο την απόδοση καινοτόμων αποτελεσμάτων. Mη γραμμικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για την μελέτη έργων Πολιτιστικής κληρονομιάς. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε ένας ειδικά σχεδιασμένος αλγόριθμος, ο οποίος μέσα από μετρήσεις MPEF προσδιορίζει με μεγάλη ακρίβεια το πάχος του προστατευτικού στρώματος βερνικιού σε ένα ομοίωμα έργου τέχνης βοηθώντας έτσι, στη διαδικασία αποκατάστασης αυτού.