Allosteric interactions between GB1 andGB2 subunits are required for optimalGABAB receptor function

Abstract

T.Galvez and B.Duthey contributed equally to this workRecent studies on G-protein-coupled receptors revealed that they can dimerize. However, the role of each subunit in the activation process remains unclear. The g-amino-n-butyric acid type B (GABA B ) receptor is comprised of two subunits: GB1 and GB2. Both consist of an extracellular domain (ECD) and a heptahelical domain composed of seven transmembrane a-helices, loops and the C-terminus (HD). Whereas GB1 ECD plays a critical role in ligand binding, GB2 is required not only to target GB1 subunit to the cell surface but also for receptor activation. Here, by analysing chimeric GB subunits, we show that only GB2 HD contains the determinants required for G-protein signalling. However, the HD of GB1 improves coupling ef®cacy. Conversely, although GB1 ECD is suf®cient to bind GABA B ligands, the ECD of GB2 increases the agonist af®nity on GB1, and is necessary for agonist activation of the receptor. These data indicate that multiple allosteric interactions between the two subunits are required for wild-type functioning of the GABA B receptor and highlight further the importance of the dimerization process in GPCR activation.

Surface expression of metabotropic glutamate receptor variants mGluR1a and mGluR1b in transfected HEK293 cells

“…We previously reported that the insertion of these tags after the signal peptide, and before the Venus fly trap (VFT) ligand binding domain does not alter functional properties of class C GPCRs (both mGlu and GABAb receptors) (Ango et al, 2000;Galvez et al, 2001;Havlickova et al, 2002;Hlavackova et al, 2005;Pagano et al, 2001). We used wild type receptors where possible in order to verify results obtained with our N-terminally tagged proteins.…”

“…Constructs HA-mGluR1 and HA-GB1a and HA-GB2 were used and described in our previous studies (Ango et al, 2000;Galvez et al, 2001;Havlickova et al, 2003;Hlavackova et al, 2005;Pagano et al, 2001). MGluR1b variant was tagged using the same strategy.…”

“…To allow detection of the recombinant receptors on cell surface the N-terminal 16 residues of rat GB1a and N-terminal 41 residues of rat GB2 were replaced by 36 residues encoding the mGluR5 signal peptide, and HA epitope. The adaptor Gqi9 protein, based on sequence of Gq with last 9 residues replaced by extreme C terminal 9 residues from Gi sequence was described (Conklin et al, 1993) and used previously in our studies (Franek et al, 1999;Galvez et al, 2001;Havlickova et al, 2003). All constructs were sequenced using Big Dye Terminater v. 3,1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).…”

Des dimères et des oligomères de récepteurs couplés aux protéines G, oui mais pourquoi ?

“…En effet, seule la sous-unité GABA B1 lie le GABA, alors que GABA B2 est nécessaire à l'activation des protéines G [5,6], indiquant un fonctionnement asymétrique d'un dimère de RCPG, décrit depuis pour d'autres RCPG hétérodimériques, mais aussi homodimériques [7]. Chacune de ces sous-unités est constituée d'un Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des acteurs importants de la communication cellulaire.…”

“…À l'image de celui proposé pour les autres RCPG de la classe C, et notamment pour les récepteurs métabotropes du glutamate (mGlu), l'activation des messagers intracellulaires en réponse à la liaison de l'agoniste dans le domaine extracellulaire du récepteur provient de changements de conformation importants au sein du dimère [11,12]. Dans le cas du récepteur GABA B , si l'activation est initiée par la liaison du GABA dans le VFT de la sous-unité GABA B1 et la fermeture de ce domaine [13], la stimulation des cascades de signalisation, et notamment des protéines G, requiert des changements de conformation au sein du domaine membranaire de GABA B2 [6,14]. La transmission conformationnelle au sein de l'hétérodimère, depuis la fermeture du domaine VFT de GABA B1 vers le domaine membranaire de GABA B2 , se produit par deux voies concomitantes (Figure 2).…”