An alternative method for the genetic transformation of sweet organce

Abstract

An alternative method for transforming sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] has been developed. Plasmid DNA encoding the non-destructive selectable marker enhanced green fluorescent protein gene was introduced using polyethylene glycol into protoplasts of`Itaborai' sweet orange isolated from an embryogenic nucellar-derived suspension culture. Following protoplast culture in liquid medium and transfer to solid medium, transformed calluses were identified via expression of the green fluorescent protein, physically separated from non-transformed tissue, and cultured on somatic embryogenesis induction medium. Transgenic plantlets were recovered from germinating somatic embryos and by in vitro rooting of shoots. To expedite transgenic plant recovery, regenerated shoots were also micrografted onto sour orange seedling rootstocks. Presence of the transgene in calluses and regenerated sweet orange plants was verified by gene amplification and Southern analyses. Potential advantages of this transformation system over the commonly used Agrobacterium methods for citrus are discussed.

Transformação genética de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 e avaliação de plantas transgênicas inoculadas com Xylella fastidiosa Wells et al.

“…A primeira laranja transgênica regenerada foi obtida a partir de células embriogênicas em suspensão da variedade 'Washington Navel' co-cultivadas com Agrobacterium tumefaciens (HIDAKA et al, 1990). Vários métodos de transformação genética já foram descritos para citros, como a introdução direta de DNA em protoplastos (KOBAYASHI; UCHIMIYA, 1989;VARDI;BLEICHMAN;AVIV, 1990;GUO et al, 2005), transformação via A. tumefaciens (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;BOND;ROOSE, 1998;CERVERA et al, 1998;MOORE, 1999;MENDES et al, 2002;ALMEIDA et al, 2003), o bombardeamento de partículas em células vivas (KLEIN et al, 1987;YAO et al, 1996) e por eletroporação de protoplastos (HIDAKA; OMURA, 1993;NIEDZ et al, 2003).…”

“…Diversos fatores podem afetar a eficiência de transformação, como o cultivo (CERVERA et al, 1998;PEÑA et al, 1997), a estirpe de Agrobacterium (HOLFORD; HERNANDEZ; NEWBURY, 1992; GUTIÉRREZ-E; LUTH; MOORE, 1997), o tipo de explante (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;MENDES et al, 2002), o genótipo utilizado , e as condições de incubação no co-cultivo (BARBOSA, 2002;MENDES et al, 2002).…”

“…Nos trabalhos de transformação genética em citros, é bastante comum a utilização do gene de seleção nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina, assim como a utilização do gene repórter GUS PEÑA et al, 2001;MENDES et al, 2002;MOLINARI et al, 2004;AZEVEDO et al, 2006) ou GFP (GHORBEL et al, 1999;FLEMING et al, 2000). Entretanto, muitos trabalhos relatam um grande número de escapes (gemas adventícias regeneradas não transformadas), indicando que a canamicina restringe mas não inibe completamente a regeneração de escapes (PEÑA et al, 1997).…”

“…A maioria das construções gênicas utilizadas nas transformações em citros, possui o gene de interesse dirigido pelo promotor constitutivo 35S, obtido a partir do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (FLEMING et al, 2000;BESPALHOK FILHO et al, 2001;MOLINARI et al, 2004;DOMÍNGUEZ et al, 2004). Esse promotor é caracterizado pela alta expressão nos tecidos das plantas, porém não apresenta especificidade.…”

Transformação genética de laranjas 'Pera' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene atacina A (attA), dirigido por promotores preferencialmente expressos no floema, para resistência a Candidatus Liberibacter spp.

“…Dentre eles, eletroporação de protoplastos (HIDAKA; OMURA, 1993;FLEMING et al, 2000;McCKENDREE;SHATTERS, 2003), biobalística (YAO et al, 1996) e via Agrobacterium tumefaciens (HIDAKA et al, 1990;ALMEIDA et al, 2003;BOSCARIOL et al, 2006;AZEVEDO et al, 2006a;BARBOSA-MENDES et al, 2009) A maioria dos porta-enxertos de citros são intolerantes a salinidade ou ao déficit hídrico. Assim, diversos trabalhos reportam a transferência de genes relacionados ao ajuste osmótico ou estabilização de membrana.…”