Biological consequences of complex DNA damage induced by high-LET ionizing radiations

Abstract

Η αλληλεπίδραση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας (ΙΑ) με τη βιολογική ύλη είναι ένα φαινόμενο που η πλήρης αποσαφήνισή του βοηθά τόσο στην κατανόηση της πρόκλησης νεοπλασίας όσο και στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της νόσου. Αυτό συμβαίνει διότι η ΙΑ αφενός αποτελεί γενεσιουργό αιτία του καρκίνου καθώς προκαλεί μεταλλάξεις και αφετέρου είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μέσο στην καταπολέμησή του, μέσω της ακτινοθεραπείας. Η έκθεση σε ΙΑ επάγει βλάβες στο κυτταρικό DNA, οι οποίες παρουσιάζουν ποικιλία και αρκετές φορές αυξημένη πολυπλοκότητα. Οι ομαδοποιημένες (σύνθετες) βλάβες του DNA και κυρίως οι δίκλωνες θραύσεις, θεωρούνται ως οι περισσότερο επιβλαβείς, καθώς αν δεν επιδιορθωθούν μπορεί να οδηγήσουν σε κρίσιμες συνέπειες για την κυτταρική επιβίωση και αυξημένο κίνδυνο μεταλλάξεων και καρκινογένεσης. Αποτελούν δε και τον κύριο παράγοντα πίσω από τις βιολογικές επιδράσεις αυξανομένης της γραμμικής μεταφοράς ενέργειας (LET) της ακτινοβολίας, μιας φυσικής ποσότητας που περιγράφει τη μέση ενέργεια που εναποτίθεται ανά μονάδα μήκους της τροχιάς των σωματιδίων στην ύλη και καθορίζει σε σημαντικό βαθμό τις συνέπειες που θα υποστεί το βιολογικό υλικό. Αντικείμενο της εν λόγω διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη των ομαδοποιημένων βλαβών που προκαλούνται στο DNA των κυττάρων λόγω της δράσης της ΙΑ. Μελετήθηκαν η επαγωγή και η επιδιόρθωση των σύνθετων βλαβών DNA σε διάφορες κυτταρικές σειρές, μετά την έκθεση σε ακτινοβολίες διαφορετικής ποιότητας. Πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενα πειράματα in situ έμμεσου ανοσοφθορισμού, για την προτυποποίηση και καθιέρωση του πρωτοκόλλου ανίχνευσης ομαδοποιημένων βλαβών DNA. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται εκτενώς για την ανίχνευση των βλαβών DNA, μιας και τα εκατοντάδες/χιλιάδες μόρια της επιδιορθωτικής πρωτεΐνης που εμπλέκονται καθιστούν δυνατή την οπτικοποίηση των αντίστοιχων εστιών (foci) με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου φθορισμού. Η έρευνα επικεντρώνεται στις σύνθετες βλάβες που περιέχουν τουλάχιστον μία δίκλωνη θραύση DNA και ορισμένες οξειδωτικές βλάβες βάσεων. Για τις δίκλωνες θραύσεις επιλέχθηκε ως δείκτης η ιστόνη Η2ΑΧ στη φωσφορυλιωμένη της μορφή (γ-Η2ΑΧ) και για τις οξειδωτικές βλάβες η πρωτεΐνη OGG1. Αρχικά, έγινε η σύγκριση της επαγωγής και της επιδιόρθωσης των σύνθετων βλαβών DNA που προκλήθηκαν μετά από έκθεση σε πρωτόνια χαμηλής- και υψηλής- L.E.T. που χρησιμοποιούνται στην ακτινοθεραπεία, ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε η επαγωγή των σύνθετων βλαβών DNA μετά από έκθεση σε διάφορους βαρείς πυρήνες υψηλής-LET, που συναντώνται στην κοσμική ακτινοβολία. Επιπροσθέτως, προκειμένου να μελετηθούν οι βιολογικές επιπτώσεις του σχηματισμού δίκλωνων θραύσεων χρησιμοποιήθηκαν κλώνοι μιας κυτταρικής σειράς με πολλαπλές ενσωματώσεις της ειδικής ενδονουκλεάσης I-SceI στο γονιδίωμά τους. Μέσω αυτής της γονιδιωματικής τεχνολογίας μπορεί να πραγματοποιηθεί η ελεγχόμενη δημιουργία δίκλωνων θραύσεων από το περιοριστικό ένζυμο I-SceI σε συγκεκριμένα σημεία, επιτρέποντας έτσι τη μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων του σχηματισμού απλών και ομαδοποιημένων δίκλωνων θραύσεων DNA. Η κυτταρική επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της κλωνογενετικής επιβίωσης, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και ο σχηματισμός χρωμοσωμικών αλλοιώσεων μέσω κλασικής κυτταρογενετικής ανάλυσης. Συνολικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υπογραμμίζουν τη βιολογική σημαντικότητα των σύνθετων βλαβών DNA, παρέχοντας σαφείς ενδείξεις του σχηματισμού τους ύστερα από έκθεση σε ΙΑ υψηλής-LET και των επιβλαβών βιολογικών επιπτώσεών τους.