Cathepsin D released by lactating rat mammary epithelial cells is involved in prolactin cleavage under physiological conditions

Abstract

The 16 kDa prolactin fragment arises from partial proteolysis of the native 23 kDa prolactin pituitary hormone. The mammary gland has been involved in this processing, although it has not been clarified whether it occurs in stroma or epithelial cells or extracellularly. Also, the processing enzyme has not been defined yet. Here we show that the incubation medium of stroma-deprived mammary acini from lactating rat contains an enzymatic activity able to cleave, in a temperature- and time-dependent fashion, the 23 kDa prolactin to generate a 16 kDa prolactin detectable under reducing conditions. This cleavage was not impaired in the presence of hirudin, a thrombin inhibitor, but strongly weakened in the presence of pepstatin A, a cathepsin D inhibitor. Cathepsin D immuno-depletion abolished the capability of acini-conditioned medium to cleave the 23 kDa prolactin. Brefeldin A treatment of acini, a condition that largely abolished the apical secretion of milk proteins, did not impair the secretion of the enzymatically active single chain of cathepsin D. These results show that mature cathepsin D from endosomes or lysosomes is released, likely at the baso-lateral site of mammary epithelial cells, and that a cathepsin D-dependent activity is required to effect, under physiological conditions, the cleavage of 23 kDa prolactin in the extracellular medium. This is the first report demonstrating that cathepsin D can perform a limited proteolysis of a substrate at physiological pH outside the cell.

La prolactine et son fragment 16 kDa dans les tissus de mammifères

“…Chez l'homme et plusieurs mammifères, les ARNm et la PRL elle-même sont aussi exprimés dans la glande mammaire et dans le lait, où coexistent diverses formes moléculaires de la PRL (14,18,20,23,25 kDa) [7,8]. La forme 16K n'a jamais été décrite dans les cellules mammaires ni dans le lait, mais elle est retrouvée dans les milieux conditionnés de tissu mammaire en culture [9]. De même, les cellules endothéliales du corps jaune et les cellules de type granulosa ont des récepteurs de la PRL et peuvent synthétiser l'hormone.…”

“…Il a été longtemps admis que le clivage de la PRL avait lieu uniquement dans les lysosomes au pH acide (pH < 5,5). Toutefois, des données récentes suggèrent que le clivage de la PRL par la CD peut avoir lieu à l'extérieur des cellules [9,30]. Ceci soulève la question de la valeur de pH à laquelle la CD peut exercer une activité protéolytique dans le milieu interstitiel.…”

“…Des conditions locales de micro-acidification dépendante de pompes à protons pourraient faciliter l'activité des protéases [30]. Ainsi, les milieux conditionnés de tissu mammaire de rate en lactation sont capables de cliver la PRL de rat à pH 7 et ce clivage nécessite la présence de CD active dans le milieu [9], ce qui n'est pas le cas pour la PRL humaine [29]. Chez la souris, un clivage partiel de la PRL est observé dans des milieux conditionnés de rein à pH neutre [30].…”

“…La CD est libérée dans les milieux de culture de lignées de cellules mammaires normales et tumorales sous une forme protéolytiquement inactive [32]. En revanche, dans les cellules mammaires polarisées, la PRL 23 kDa stimule la sécrétion de la forme mature simple de la chaîne active de la CD, vers le milieu extracellulaire basal, exerçant ainsi un contrôle sur la sécrétion de l'enzyme susceptible de la cliver [9,31].…”

“…Dans des conditions physiologiques normales, la vascularisation mammaire se développe au cours de la première moitié de la gestation, puis la prolifération du réseau vasculaire s'arrête pendant la lactation quand les taux de PRL circulante sont très élevés. Dans les tissus mammaires pendant la lactation, le clivage de la PRL 23 kDa dans le milieu extracellulaire du côté basal de l'épithé-lium mammaire libérerait la PRL 16K à proximité des capillaires sanguins, assurant ainsi un contrôle antiangiogénique pendant cette période [9]. Au cours des phases prolifératives tumorales, les cellules mammaires perdent leur polarité et les caractéristiques sécrétoires permettant cette régulation.…”