Cloning, Expression and Extraction From Escherischia Coli of a Human Protein Keratin 17 Translationally Fused to Glutathione S-Transferase

Abstract

Согласно аутоиммунной гипотезе, развитие ошибочного иммунного ответа при псориазе вызвано фе-номеном «молекулярной мимикрии». Данный феномен заключается в структурном сходстве собственного белка организма с антигенами различных микроорганизмов. В случае псориаза рассматривается гомология аминокислотной последовательности белка кератина 17 с М белком стрептококка (Streptococcus pyogenes). Кератин 17 (K17) -представитель большого семейства белков промежуточных филаментов цитоскелета, высоко экспрессирующийся в пораженных псориазом участках кожи и полностью отсутствующий в здоро-вом эпидермисе. Экспрессия K17 резко возрастает при патологиях, характеризующихся воспалением в коже, включая механическое повреждение ткани (травмы) и псориаз. Было высказано предположение о вероятной роли K17 в качестве важного молекулярного игрока, вовлеченного в сложный многоуровневый процесс взаимодействия между клетками кожи и Т-лимфоцитами, а следовательно, о возможном вкладе этого белка в развитие патологий, характеризующихся спонтанной пролиферацией клеток, характерной для псориаза. Целью работы было клонирование, экспрессия и выделение в бактериальной системе (Escherichia coli) ре-комбинантного белка K17 для последующего изучения его функциональной активности и обнаружения ау-тореактивных к кератину 17 иммунных клеток у больных псориазом. Амплифицированный фрагмент кДНК гена KRT17 человека клонировали в вектор pGEX4T1 для экспрессии рекомбинантного белка кератина 17, трансляционно слитого с глутатион-S-трансферазой (GST). Биосинтез GST/K17 осуществляли в трансфор-мированных клетках Е. coli BL21. Рекомбинантный белок был очищен методами аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе. Количество и чистота выделенного белка оказались достаточными для изучения его функциональной активности с последующим проведением исследований по обнаружению у больных псо-риазом аутореактивных к кератину 17 Т-лимфоцитов крови.Ключевые слова: псориаз, кератин 17, клонирование гена, экспрессия, GST-слитый белок.Кератин 17 (К17), белок массой 44 кДа -представитель большого семейства белков про-межуточных филаментов, образующих цито-скелет клетки. В отличие от большинства бел-ков огромного семейства кератинов, присутст-вующих во всех слоях кожного покрова и экс-прессирующихся постоянно, в здоровом эпи-дермисе кератин 17 вырабатывается исключи-тельно в волосяных фолликулах, ногтевых пла-стинках, сальных и потовых железах [1]. Экс-прессия К17 резко увеличивается при разли-чных патологических состояниях, характери-зующихся воспалительным процессом, включая механическое повреждение кожи (ранения), различные карциномы, вирус-индуцированные опухоли и псориаз [2][3][4][5]. Псориаз представляет собой аутоиммунное системное заболевание организма, характеризующееся гиперпролифе-рацией эпидермальных кератиноцитов, хрони-ческим воспалением и инфильтрацией Т-лимфоцитов в коже. Характерной особенно-стью псориатических участков кожи является неполная терминальная дифференцировка кера-тиноцитов, которая является результатом нару-шений в регуляции процесса пролиферации кле...