A triagem neonatal biológica, popularmente conhecida como "teste do pezinho", é um teste preventivo capaz de identificar seis doenças em neonatos, sendo elas a Fenilcetonúria, o Hipotireoidismo Congênito, a Doença Falciforme e outras hemoglobinopatias, Fibrose Cística, Hiperplasia Adrenal Congênita e a Deficiência de Biotinidase. Este estudo objetivou avaliar o conhecimento dos profissionais da Estratégia Saúde da Família sobre a triagem neonatal biológica. Foi realizado um estudo descritivo, exploratório e de caráter quantitativo, desenvolvido com profissionais da equipe de Estratégia Saúde da Família nas Unidades Básicas de Saúde de um município no noroeste do estado do Paraná. Os dados foram coletados por meio de formulário na plataforma Google Forms e em material impresso, analisados descritivamente por meio de frequências absolutas e relativas. Evidenciaram-se que dos 69 profissionais pesquisados, 39 não sabem elencar quais doenças o teste identifica (56,5%), 28(40,6%) indicaram o período ideal como sendo entre o 3º e 5º dia de vida; e 20(29%), indicaram o período antes de 48 horas de vida, 46(66,7%) não se sente capacitado para orientar os pais sobre o teste. Após o nascimento da criança, 34(49,3%) não verificam se foi realizado o teste. Concluiu-se, portanto, que o conhecimento e atitude dos profissionais das Equipes de Estratégia Saúde da Família em relação à triagem neonatal biológica é insuficiente, e mostra a importância da educação permanente, que os profissionais ampliem seus conhecimentos e sintam-se seguros para orientar em relação ao teste do pezinho efetivamente.