Construcción de una genoteca de Plasmodium falciparum en el fago lambda EMBL-4 y aislamiento de clonos que contienen la secuencia repetitiva de 692 pares de bases (PFCOL692)

Abstract

Se construyó una genoteca de Plasmodium falciparum en el fago lambda EMBL-4. Se aislaron 28 clonos c o n insertos entre 14.000 y 23.000 pares de bases (pb) que hibridizan con la secuencia PFCOL69, utilizando como sonda el plásmido recombinante p U C l 8 que contiene u n fragmento de DNA correspondiente a una nueva secuencia repetitiva del parásito (PFCOL692). Se describe la metodología usada para la construcción de la genoteca y para e l aislamiento de los clonos y se discute s u importancia en el estudio de la biología molecular del parásito. Para estudios epidemiológicos de malaria se ha venido intentando desarrollar técnicas que permitan el manejosimultáneo de un gran núme-ro de muestras y el diagnóstico especifico para cada una de las especies de Plasmodium. Una estrategia ha sido la utilización de sondas de DNA construidas con base en secuencias repetitivas dentro del genoma (1) y en RNA ribosomal (2); sin embargo, ningún estudio ha aportado resultados definitivos de manejo de muestras, sensibilidad y especificidad.Hasta el momento el estudio de las secuen genoma del parásito (datos no publicados), se encuentra en 13 de los cromosomas (5) y es diferentealassecuencias repetidasde Plasmod~um falciparum reportadas (1, 6, 7, 8 y 9). La identificación de la secuencia se llevó a cabo en una genotecaconstruida utilizando el plásmido pUC18; con el estudiodeclonosobtenidosdeunagenoteca en elfago lambda EMBL-4 que permite laclonación de fragmentos de mayor tamaiio, conoceremos mejor la estructura y la localización y se podrán plantear hipótesis sobre la función del PFCOL692. MATERIALES Y METODOScias repetidas en el Plasmod~um ha sido orien-AislamientodelDNAdePlasmodiumfalcipar~m tado con fines diaqnósticos, nada se ha ~ublica-do sobre su funcrón. Trabajos en el G;U~O de Seaislóel DNAapartirdeuncultivoasincrónico Bioquimicadel Instituto Nacional de Salud (3,4,5) de la cepa FCB-2 con parasitemias entre el 5 y han llevado al aislamiento de un fragmento de 10% (10). Se liberó el parásito de los eritrocitos DNAde 1384 pb quecontienedos copiasde una mediante lisis con saponina (1 1). Se lisó el pará-secuencia de 692 y se repite 60 veces en el sito incubando en un buffer que contiene: Tris 10

Ubicación de la secuencia repetitiva PFCOL692 en fragmentos genómicos de Plasmodíum falciparum

“…Crecimiento y purificación de fagos recombinantes AEMBL4/PFCOL692 (27-28) de P. falciparum con la que cuenta el Laboratorio de Bioquimica (22), construidaen el fago AEMBL4; estos clones tienen insertos de ADN con un tamaño entre 15-23 Kb y contienen la secuencia repetitiva PFCOL692 y regiones aledañas a ésta en el genoma. Para amplificar los clones.…”

“…En 1988, en el Laboratorio de Bioquimica del Instituto Nacional de Salud, se encontró una secuencia moderadamente repetitiva, especifica y diferente a otras reportadas para P. falciparum (21)(22) que tiene una longitud de 692 pb, está presente aproximadamente 60 veces en el genoma y no es una secuencia codificadora. En el análisis de ADN de P. falciparum procedente de cepas de Africa, Asia y América se detectó esta repetición en 11 de los 14 cromosomas con una distribución heterogénea del número de copias (1 9).…”

“…estuvieron orientados a caracterizar las zonas adyacentes a ésta con el fin de ubicarla dentro del genoma de P. falciparum. Para ello, se construyó una genoteca en el fago hEMBL4 que permitió clonar fragmentos entre 15-23 Kb (22); los clones de esta genoteca se han caracterizado por tratamiento con enzimas de restricción y posterior hibridación con una sonda subtelomérica (22)(23)(24)(25). Hasta el momento, los resultados indican que PFCOL692 se ubica en la región subtelomérica Recibido: 02107139; aceptado: 21/02/00 -de los cromosomas y por el hecho de ocupar regiones extensas no espaciadas por otras secuencias.…”