Development and validation of protocols for virus, viroid and phytoplasma detection to be used for the certification of pome fruit propagation material

Abstract

Ήδη από τη δεκαετία του 60 η έρευνα για τις ιώσεις και τις συναφείς με αυτές ασθένειες των γιγαρτόκαρπων είχε αρχίσει να συστηματοποιείται καθώς γίνονταν αντιληπτές οι σημαντικές οικονομικές απώλειες που προκαλούν. Τα γιγαρτόκαρπα πολλαπλασιάζονται με εμβολιασμό της επιθυμητής ποικιλίας σε κατάλληλο υποκείμενο. Καθώς οι ιοί, τα ιοειδή και τα φυτοπλάσματα που τα προσβάλλουν είναι εμβολιο-μεταδιδόμενα, διασπείρονται και μεταφέρονται ακούσια με το πολλαπλασιαστικό υλικό. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επίσημα διαγνωστικά πρωτόκολλα για τα περισσότερα από αυτά τα παθογόνα ενώ παράλληλα, με την ολοένα και ευρύτερη εφαρμογή της αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High-Throughput Seguencing, HTS), ανακαλύπτονται διαρκώς νέοι ιοί και ιοειδή που πιθανόν να σχετίζονται με ασθένειες των γιγαρτόκαρπων. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν αρχικά να αναπτυχθούν διαγνωστικά πρωτόκολλα, βασισμένα σε σύγχρονες μοριακές τεχνικές, για τους πιο κοινούς ιούς, ιοειδή και φυτοπλάσματα που προσβάλλουν τα γιγαρτόκαρπα, ώστε να εφαρμοστούν κατά τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού. Παράλληλα, στόχος ήταν η εν μέρει επικαιροποίηση των δεδομένων για τη διασπορά και τη συχνότητα εμφάνισης των γνωστών ιών και ιοειδών που απαντώνται στις καλλιέργειες γιγαρτόκαρπων της Ελλάδας αλλά και η μελέτη της γενετικής ποικιλομορφίας τους. Τέλος, επιδιώχθηκε η διαπίστωση της ύπαρξης τυχόν νέων ιών και ιοειδών των γιγαρτόκαρπων στην Ελλάδα και η ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσής τους. Για την πραγματοποίηση των στόχων της εργασίας, έγινε σχεδιασμός δύο δοκιμών, αντίστροφης μεταγραφής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-qPCR) με ιχνηλάτες για την ταυτόχρονη ανίχνευση τριών στόχων σε ένα δείγμα με μία αντίδραση. H πρώτη δοκιμή αναπτύχθηκε για την ταυτόχρονη ανίχνευση των ιών της βοθρίωσης του ξύλου της μηλιάς (apple stem pitting virus), του αυλακωτού ξύλου της μηλιάς (apple stem grooving virus) και του μωσαϊκού της μηλιάς (apple mosaic virus), και η δεύτερη για τα ιοειδή της εσχάρωσης του φλοιού των μήλων (apple scar skin viroid), του εξανθηματικού έλκους της αχλαδιάς (pear blister canker viroid) και καθολικά των φυτοπλάσματων. Λόγω της υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας, σχεδιάστηκαν μικρότερου μήκους ιχνηλάτες στους οποίους συζεύχθηκαν μόρια που προσδένονται στην ελάσσονα αύλακα του DNA (minor groove binder, MGB) και τα οποία προσδίδουν τη δυνατότητα αποτελεσματικού και εξειδικευμένου υβριδισμού του ιχνηλάτη στο στόχο σε υψηλές θερμοκρασίες. Οι μέθοδοι συνδυάστηκαν με πρωτόκολλα εξαγωγής ολικών νουκλεϊκών οξέων βασιζόμενα στην τασιενεργό ουσία CTAB, ακολούθησε βελτιστοποίηση των συνθηκών των αντιδράσεων για πολλαπλή, ταυτόχρονη ενίσχυση των στόχων καθώς και δοκιμές για την ευαισθησία, εξειδίκευση και επαναληψιμότητά τους. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και έγινε σύγκριση με συμβατικές μεθόδους, η οποία έδειξε 10-100 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία των νέων δοκιμών. Και τα δύο πρωτόκολλα παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία, αποτελεσματικότητα και αξιοπιστία στην ανίχνευση των κυριότερων ιών και συναφών παθογόνων των γιγαρτοκάρπων, είτε αυτά διέθεταν RNA είτε DNA γονιδίωμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επισκόπηση καλλιεργειών μηλιάς σε τρεις διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας – στην Τεγέα, η οποία ανήκει στην περιφερειακή ενότητα Αρκαδίας στην Πελοπόννησο, και στην Αγιά και τη Ζαγορά της περιφέρειας Θεσσαλίας– για συλλογή δειγμάτων με συμπτώματα ιώσεων ή και ασυμπτωματικών. Τα δείγματα ελέγχθηκαν με τα νέα πρωτόκολλα και η αυξημένη ευαισθησία τους συνέβαλε στην επικαιροποίηση των δεδομένων από προηγούμενες έρευνες για τη συχνότητα εμφάνισης και διάδοσης του κάθε ιού στην Ελλάδα. Επιλεγμένα δείγματα αναλύθηκαν κατά ομάδες με εφαρμογή της HTS. Από την βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων, προέκυψαν για πρώτη φορά σχεδόν πλήρεις αλληλουχίες του γονιδιώματος ελληνικών απομονώσεων των κυριότερων ιών οι οποίες επιβεβαίωσαν και in silico την αποτελεσματικότητα των ολιγονουκλεοτιδίων που σχεδιάστηκαν ενώ πραγματοποιήθηκαν και φυλογενετικές αναλύσεις. Επίσης, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία τεσσάρων πρόσφατα ανακαλυφθέντων ιών και ενός ιοειδούς στις μηλιές (apple rubbery wood virus 1 και 2, citrus concave gum-associated virus, apple luteovirus 1, apple hammerhead viroid) αλλά και ενός πιθανολογούμενου νέου ιού του γένους Cytorhabdovirus. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της HTS, αναπτύχθηκαν συμβατικές RT-PCR και ακολούθησε αλληλούχηση Sanger. Ο έλεγχος όλων των δειγμάτων για αυτά τα παθογόνα έδωσε μια ενδεικτική πρώτη εκτίμηση της διασποράς τους στους οπωρώνες. Το ιολογικό φορτίο (ίωμα) της μηλιάς στις τρεις διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας παρουσίασε διαφορές ως προς τον πλούτο της σύνθεσής του οι οποίες αντικατοπτρίζουν τη χρήση ή όχι πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού και την ηλικία των οπωρώνων της κάθε περιοχής. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μία πρώτη λεπτομερή καταγραφή του ιώματος της μηλιάς στην Ελλάδα και προσφέρει ένα περιεκτικό σύνολο διαγνωστικών πρωτοκόλλων για την ανίχνευση των σημαντικότερων γνωστών αλλά και των προσφάτως ανακαλυφθέντων ιών, ιοειδών και φυτοπλασμάτων των γιγαρτόκαρπων, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον έλεγχο και την πιστοποίηση του πολλαπλασιαστικού υλικού γιγαρτόκαρπων με στόχο έναν υγιέστερο και βιώσιμο οπωρώνα.