Development and validation of real time polymerase chain reaction for detection DNA of pathogenic leptospira

Abstract

1 Інститут ветеринарної медицини НААН 2 Білоцерківський національний аграрний університет 3 Національна академія аграрних наук України РОЗРОБКА ТА ВАЛІДАЦІЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ У РЕЖИМІ РЕАЛЬНОГО ЧАСУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ПАТОГЕННИХ ЛЕПТОСПІР У статті наведені результати розробки та валідації методики полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу для детекції ДНК патогенних лептоспір за міжнародними вимогами. Встановлено, що розроблена праймерна система проявляє виражену гібридизаційну активність по відношенню до ДНК-матриці при 45ºС з концентрацією іонів магнію у реакційній суміші 1,5 мМ/мкл. Представлені показники визначення чутливості, межі виявлення та специфічності методики, які свідчать про можливість її застосування з метою виявлення ДНК патогенних лептоспір при діагностиці лептоспірозу в господарствах України. Ключові слова: лептоспіра, ДНК, ПЛР у режимі реального часу, протокол ампліфікації, оптимізація.Вступ. Лептоспіроз це один з найпоширеніших у всьому світі антропозоонозів, у природних умовах частіше хворіють свині та велика рогата худоба, сприйнятливі також коні, вівці, кози, буйволи, лисиці, норки, песці, птиця, собаки, білі миші, комахоїдні, хижаки і сумчасті. За своєю актуальністю, епізоотологічним значенням він знаходиться поряд з туберкульозом та бруцельозом, а за кількістю відомих сероварів лептоспіри поступаються лише ентеробактеріям [1,2]. У світі спостерігається щонайменше 0,5 млн. випадків захворювання людей в рік, а рівень смертності від лептоспірозу у людей коливається від 5% до 15% [3]. збудником хвороби є спірохети, котрі виділені в самостійне сімейство Leptospiraceae, порядку Spirochaetalis, в який включений рід Leptospira, об'єднуючий два види лептоспір: L. interrogans (патогенні лептоспіри) та L. biflexa (лептоспіри-сапрофіти).В останній час проводяться активні досліди з розробки і використання ПЛР з метою визначення генетичних та патологічних характеристик лептоспір та діагностики лептоспірозу [4].