Die Konformation der Prionendomäne von Sup35: isoliert und im Kontext des Volllängen‐Proteins

Abstract

Das Sup35p-Hefeprotein zeigt Prioneneigenschaften [1] und bildet fibrilläre Aggregate. [2] Es ist der Auslçser des [PSI + ]-Phänotyps in der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae. [3] Das Sup35p-Hefeprion ist ein wichtiges Modellsystem zur Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung von Prionen. Um den Schwierigkeitsgrad der Untersuchungen zu verringern, wird das Sup35pNM-Fragment häufig stellvertretend als Modell zur Beschreibung des Aufbaus und der infektiçsen Eigenschaften des Volllängen-Prions verwendet, da fibrilläres Sup35pNM biologisch relevant ist in dem Sinne, dass es [PSI + ] induziert, wenn es in [psi À ]-Zellen eingeführt wird. [4] Die Annahme, dass fibrilläres Sup35pNM das Verhalten von Sup35p-Fibrillen gänzlich imitiert, setzt voraus, dass die N-und M-Domänen von Sup35p identische Konformationen in Sup35pNM-und Sup35p-Fibrillen zeigen. [5] Wir hinterfragen diese Annahme im Folgenden: Mithilfe von Festkçrper-NMR-Messungen am Sup35pNM Fragment und an Volllängen-Sup35p-Fibrillen, welche unter identischen physiologischen Bedingungen fibrillisiert wurden und beide [PSI + ] induzieren (wie in Abbildung S1 gezeigt), legen wir dar, dass die Sup35pNM-und Volllängen-Sup35p-Fibrillen deutlich unterschiedliche Strukturen aufweisen, obgleich beide einen hohen b-Faltblatt-Anteil zeigen.Sup35p ist ein Drei-Domänen-Polypeptid (Tabelle S1); die N-terminale Domäne ist für die Prionen-Ausbreitung verantwortlich, während die C-terminale Domäne GTPase-Aktivität zeigt und an der Translationsbeendigung beteiligt ist. [6] Die mittlere Domäne (M) verbindet die beiden Domänen. Die N-Domäne alleine, zusammen mit der M-Domäne oder als Teil von Volllängen-Sup35p, bildet Amyloid-Fibrillen. [5a,b, 7] Fibrillen sowohl von Sup35p als auch von Sup35pNM ermçglichen die Aufnahme hochaufgelçster Festkçrper-NMR-Spektren, wie zum Beispiel der 2D-Spektren in Abbildung 1 a und 1 b für Sup35pNM und Sup35p (die Spektren sind überlagert in Abbildung S2). Ebenfalls in Abbildung 1 finden sich die zugehçrigen elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Die schmalen und gut aufgelçsten NMR-Resonanzlinien deuten auf das Vorhandensein von hoch geordneten Strukturen in beiden Fibrillen hin. Um die spektrale Auflçsung zu erhçhen, haben wir 3D-NCACB-Spektren aufgenommen, in denen jeder Aminosäurerest durch eine (N,C a ,C b )-Frequenztriade charakterisiert ist. Während man 253 und 685 Signale für Sup35pNM bzw. Sup35p erwarten würde, ist die Zahl der starken Signale in den 3D-Spektren überraschenderweise nur 35 bzw. 25 (Abbildung 2 a für eine repräsentative Ebene). Die Kombination mehrerer 3D-Experimente [8] hat uns die Resonanzzuordnung der Spin-Systeme ermçglicht, und die entsprechenden chemischen Verschiebungen für je 22 Aminosäurereste von Sup35p und Sup35pNM sind in der BMRB hinterlegt (Zu-Abbildung 1. 13 C-13 C-Korrelationsspektren (DARR) von fibrillärem Sup35pNM (a) und Sup35p (b), aufgenommen mit einer Mischzeit von 20 ms. Alle Spektren wurden bei einem Magnetfeld von 20 T und einer MAS-Frequenz von 17.5 kHz aufgezeichnet. Negativ gefärbte elektron...