DOTA-M8: An Extremely Rigid, High-Affinity Lanthanide Chelating Tag for PCS NMR Spectroscopy

Abstract

A new lanthanide chelating tag (M8) for paramagnetic labeling of biomolecules is presented, which is based on an eight-fold, stereoselectively methyl-substituted DOTA that can be covalently linked to the host molecule by a single disulfide bond. The steric overcrowding of the DOTA scaffold leads to an extremely rigid, kinetically and chemically inert lanthanide chelator. Its steric bulk restricts the motion of the tag relative to the host molecule. These properties result in very large pseudocontact shifts (>5 ppm) and residual dipolar couplings (>20 Hz) for Dy-M8 linked to ubiquitin, which are unprecedented for a small, single-point-attachment tag. Such large pseudocontact shifts should be well detectable even for larger proteins and distances beyond approximately 50 A. Due to its exceptionally high stability and lanthanide affinity M8 can be used under extreme chemical or physical conditions, such as those applied for protein denaturation, or when it is undesirable that buffer or protein react with excess lanthanide ions.

Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS

“…Distance and angular information can be obtained from nuclear Overhauser enhancements (14), three-bond scalar couplings (15), paramagnetic relaxation enhancements (PREs) (16), pseudo contact shifts (17), residual dipolar couplings (RDCs) (8,18), chemical shifts (19), and hydrogen bond scalar couplings (20). Thus, on the order of 10 geometric parameters per amino acid can be obtained with relative ease on unfolded polypeptides (21).…”

Synthesis of 1,4,7,10‐Tetra‐azacyclododecan‐1,4,7,10‐tetra‐azidoethylacetic Acid (DOTAZA) and Related “Clickable” DOTA Derivatives

“…The 1 H NMR spectra showed extremely broad lines, even at acidic pH values or elevated temperatures (330 K), as previously observed for other N-substituted cyclen derivatives. [22] We could not purify compound 15 and still observed trace impurities even after repeated chromatographic purification. We found that triazide 15 slowly decomposed by N-dealkylation through Hofmann-type elimination to afford products 16 and 17, which were observed by MS (ESI; see the Supporting Information).…”

Verbesserung der Dispersion der chemischen Verschiebungen von unstrukturierten Proteinen durch einen kovalent gebundenen Lanthanoidkomplex

“…[6] Die vorteilhaften Eigenschaften von IDPs wie etwa deren langsame Relaxation erlauben auch die Aufnahme von hochdimensionalen Spektren (bis zu 7D imensionen), was deren eindeutige Zuordnung erleichtert. [7] Weiters wurde auch die verbesserte Auflçsung von Spektren gezeigt, die durch die direkte Detektion von Heteroatomen wie 13 Co der 15 Na ufgenommen wurden. [8,9] Die erwähnten Methoden kçnnen jederzeit durch die Aufnahme von ungleich verteilten Datenpunkten (NUS) oder die Anwendung nicht Fourier-basierter Prozessierungsalgorithmen oder Schnellpulssequenzene rweitert werden, um schnellere Messungen mit hçherer Auflçsung durchzuführen.…”

“…Dieser unerwünschte Effekt konnte durch verschiedene Modifikationen entscheidend verringert werden. [14] In unserem Fall war der DOTA-M8-Ytterbiumkomplex (Yb-M8; DOTA = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure) [15] zielführend, um eine Erhçhung der Signaldispersion zu erreichen. Dieser kann bei der Komplexbildung mit verschiedenen Lanthanoiden durchaus zu einer Verdoppelung der Signale führen, bei der Verwendung von Ytterbium erreicht man aber eine fast vollständige Population von nur einem Isomer.…”