Efficient and faithful in vitro translation of natural and synthetic mRNA with human ribosomes

Ferreras, Ana Celia; Bandeira, Eduardo; Cayama, Edmundo; Zambrano, Reina; Avila, Horacio; Yépez, Antonio; Triana, Juana Ledia; Triana-Alonso, Francisco J.

doi:10.3892/ijmm.13.4.527

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“…For the mammalian translation system optimal conditions were used according to ref. ( 26 ), namely 20 mM Hepes–KOH (pH 7.5 at 0°C), 2.5 mM Mg(acetate) 2 , 150 mM K(acetate), 3.5 mM spermidine, 4 mM β-mercaptoethanol, 9% glycerol, 21 mM phosphocreatine, 0.9 mM ATP, 0.1 mM GTP. The system was homogeneous: ribosomes and S-100 proteins were from rabbit liver and tRNA bulk from bovine liver.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Features of 80S mammalian ribosome and its subunits

Budkevich

El'skaya

Nierhaus

2008

Nucleic Acids Research

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It is generally believed that basic features of ribosomal functions are universally valid, but a systematic test still stands out for higher eukaryotic 80S ribosomes. Here we report: (i) differences in tRNA and mRNA binding capabilities of eukaryotic and bacterial ribosomes and their subunits. Eukaryotic 40S subunits bind mRNA exclusively in the presence of cognate tRNA, whereas bacterial 30S do bind mRNA already in the absence of tRNA. 80S ribosomes bind mRNA efficiently in the absence of tRNA. In contrast, bacterial 70S interact with mRNA more productively in the presence rather than in the absence of tRNA. (ii) States of initiation (Pi), pre-translocation (PRE) and post-translocation (POST) of the ribosome were checked and no significant functional differences to the prokaryotic counterpart were observed including the reciprocal linkage between A and E sites. (iii) Eukaryotic ribosomes bind tetracycline with an affinity 15 times lower than that of bacterial ribosomes (Kd 30 μM and 1–2 μM, respectively). The drug does not effect enzymatic A-site occupation of 80S ribosomes in contrast to non-enzymatic tRNA binding to the A-site. Both observations explain the relative resistance of eukaryotic ribosomes to this antibiotic.

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Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Features of 80S mammalian ribosome and its subunits

Budkevich

El'skaya

Nierhaus

2008

Nucleic Acids Research

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“…La traducción del ARN-D2 se realizó en un sistema libre de células formado por la fracción posmitocondrial (S-30) de placenta humana. La obtención de esta fracción y las condiciones del ensayo de traducción para ARN mensajeros exógenos fueron descritas previamente (18) . Las mezclas de ensayo (100 µL) contenían 0,28 unidades A 260 de la fracción S-30, 42 µM de [ 14 C]-aminoácidos (Amershan) (608 dpm/pmol) y volúmenes variables de la mezcla de transcripción conteniendo 1 a 5 µg del ARN-D2.…”

Section: Traducción In Vitro Del Arn-d2unclassified

“…En algunos ensayos, la mezcla de transcripción fue incubada previamente con cada uno los OAs como se describió anteriormente. Los ensayos de traducción se incubaron a 37 ºC por 60 min y luego se procesaron para determinar la radiactividad (dpm) por contaje de centelleo líquido (18) . Los datos se analizaron con la prueba de múltiples comparaciones con el control de Dunnett, utilizando el software Statistix 8.0 para Windows.…”

Section: Traducción In Vitro Del Arn-d2unclassified

“…Traducción del ARN-D2 en el sistema libre de células de placenta humana. A) Cantidades crecientes del ARN-D2, contenido en la mezcla de transcripción, fueron incubadas con la fracción S-30 de placenta humana en un volumen final de 100 µL, bajo condiciones de ensayo para traducción in vitro previamente optimizadas (18) . B) Comparación de la actividad traduccional en ausencia (control) y en presencia 2,5 µg del ARN-D2.…”

Section: Traducción In Vitro Del Arn-d2unclassified

“…Esto corrobora que la radiactividad extra detectada en los ensayos donde está presente el ARN-D2, se debe principalmente a la síntesis del polipéptido codificado por este y que la inhibición producida por el OAs5 es específica para dicha síntesis. En los carriles no seccionados y teñidos con azul de Comassie, se observaron, principalmente, los polipéptidos contenidos en la fracción S-30 de placenta humana, con el perfil de separación esperado para este tipo de extracto celular (18) .…”

Section: Traducción In Vitro Del Arn-d2unclassified

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Traducción independiente de la estructura 5´cap del ARN genómico del virus dengue

Domínguez

Rojas

Bandeira

et al. 2015

Rev Peru Med Exp Salud Publica

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Objetivos. Analizar la participación de la caperuza metil-guanosín-trifosfato (5´cap) y de la región inicial del ARN genómico del virus dengue serotipo 2 (DENV-2) genotipo Americano en la traducción, utilizando un sistema libre de células obtenido de placenta humana. Materiales y métodos. Se preparó el plásmido recombinante pTZ18R-D2 conteniendo el ADN que codifica la 5´UTR y los primeros 201 nucleótidos de la cápside viral. Este plásmido se utilizó para transcribir el ARN correspondiente (ARN-D2), sin la 5´cap. El ARN-D2 fue traducido en un sistema constituido por la fracción posmitocondrial (S-30) de placenta humana y se evaluó la incorporación de [ 14 C] aminoácidos en presencia del ARN-D2 y en su ausencia (control). Se diseñaron siete oligonucleótidos antisentido (OAs1-7) dirigidos contra secuencias de las estructuras SLA, SLB y cHP del ARN-D2 y se analizó el efecto de los mismos sobre la traducción ARN-D2. Resultados. El ARN-D2 produjo un incremento significativo (p<0,001) en la incorporación de [ 14 C] aminoácidos, con estimulación del 75% de la actividad traduccional respecto al control. El análisis de los productos de traducción mostró un pico de incorporación correspondiente a péptidos con peso molecular aparente cercano al esperado (7,746 kDa). El OAs5, complementario a una secuencia de la estructura SLB del ARN-D2, inhibió completamente la traducción. Conclusiones. El ARN-D2 fue traducido de manera específica y eficiente, bajo condiciones semejantes a las intracelulares en humanos, por un mecanismo alternativo independiente de la 5´cap, que involucraría a la estructura SLB. Este mecanismo podría considerarse como blanco en el desarrollo de terapias antisentido para inhibir la reproducción del virus.

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Efficient and faithful in vitro translation of natural and synthetic mRNA with human ribosomes

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Traducción independiente de la estructura 5´cap del ARN genómico del virus dengue

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