Estudio de la expresión de angiostatina humana recombinante en cepas de <i>Escherichia coli</i>

Abstract

La angiogénesis se define como el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros ya pre existentes. La angiostatina es una fracción del plasminógeno de 38 KDa, que ha demostrado en estudios in vitro e in vivo poseer la capacidad de disminuir el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. La importancia de la angiostatina radica en que se observo que era capaz de inhibir específicamente la proliferación endotelial y, de forma colateral, el crecimiento de los tumores. Fue la primera proteína antiangiogénica endógena de origen natural descubierta bajo financiación de EntreMed (desde el 16 de junio de 2014 cambio su nombre a CASI Pharmaceuticals) en 1994 por los doctores Michael O' Reilly y Judah Folkman , investigadores del Hospital de Niños de Boston (EE.UU.). A la fecha, se han realizado una innumerable serie de estudios clínicos en vías de su empleo como biofármaco para el tratamiento de varias enfermedades como ser artritis reumatoidea, retinopatía diabética, glaucoma neovascular y el desarrollo de tumores. Esta tesis se refiere a la investigación sobre la expresión de angiostatina humana recombinante en diferentes cepas de Escherichia coli como sistema modelo de estudio. Para tal fin fueron utilizados dos sistemas de expresión. En un caso, mediante la inducción con IPTG. El mismo se trata del sistema de expresión comercial pET22b / BL21 (DE3), y su elección radica en que es uno de los sistemas de más alta difusión y ha sido extensamente utilizado para la obtención de proteínas recombinantes a mediana o gran escala. En el otro sistema de expresión elegido para la producción de angiostatina, la inducción ocurre por una limitación nutricional. La inducción se lleva a cabo mediante la limitación del fosfato inorgánico en el medio de cultivo, a través del promotor de la fosfatasa alcalina de E. coli ubicado en el plásmido de expresión. Ambas construcciones poseen características bien diferenciadas, por un lado la última mencionada, es una inducción gradual en el tiempo, con lo cual la adaptación celular al proceso sería mayor que en el caso de inducción por IPTG. Con el fin de caracterizar ambos sistemas, se estudiaron parámetros como ser el crecimiento celular, la estabilidad, la perdida y la amplificación del plásmido, la sobreproducción de proteína recombinante, el metabolismo celular, y algunas respuestas de estrés después de la inducción de la expresión en sistemas de cultivo continuo, cultivos en batch, tanto en erlenmeyers agitados como en biorreactor para pasar por último al sistema de batch alimentado limitado en fuente de carbono como en fosfato inorgánico. Como se mencionó, serán evaluadas diferentes cepas de E. coli en diferentes tipos de medios cultivo. El motivo es que en experiencias llevadas a cabo previamente, se evidenciaron comportamientos muy diferenciales con respecto a la estabilidad del plásmido recombinante y muy fundamentalmente sobre la producción de metabolitos indeseados que afectan la estabilidad del sistema de expresión como es el ácido acético, y se ha demostrado que su acumulación ejerce un efecto adverso sobre la expresión de diversas proteínas recombinantes. Otros parámetros intrínsecos de los microorganismos recombinantes serán estudiados como ser la evaluación de las velocidades máximas de crecimiento (μmáx), en algunos casos el coeficiente de mantenimiento celular (ms) con el objetivo de observar el impacto y el costo energético para crecer a una velocidad específica de crecimiento deseada tal que no se evidencie la aparición de ácidos orgánicos. Estos últimos trabajos se contrastaron con sus respectivas cepas silvestres, debido a que da una idea del estrés producido sobre el hospedador debido a la inducción de la expresión. Hay mucha bibliografía sobre los sistemas inducibles por IPTG pero prácticamente nada respecto al sistema de inducción por medio del promotor de la fosfatasa alcalina. Finalmente, podemos decir, en términos generales, que en la búsqueda de la optimización de la expresión de proteínas recombinantes, deben tenerse en cuenta características inherentes de los microorganismos hospedadores, como ser el problema técnico de la acumulación de acetato en el cultivo y la respuesta celular debida a la inducción. Estas últimas cuestiones se engloban en un concepto denominado carga metabólica donde generalmente se manifiesta consumo de sustrato no asociado al crecimiento. El interés estriba en redirigir los flujos metabólicos para incrementar productividad del proceso, y lograr la correcta expresión a altos niveles del gen clonado en el microorganismo huésped elegido. Desde el año 2005 se creó una vinculación entre el CINDEFI (Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales) y el Departamento de Cirugía, Programa de Biología Vascular Escuela de Medicina de Harvard y del Hospital de Niños de Boston, Massachusetts, (EE.UU), grupo de trabajo del doctor Folkman. Dicha institución aporto el material genético codificante para la angiostatina humana. A partir del mismo se planteó esta tesis donde se estudió la expresión de angiostatina como proteína modelo para estudiar la capacidad de producción de la misma expresada en E. coli recombinante inducible por IPTG y por la limitación de fosfato inorgánico en el medio de cultivo.