Evaluating the specificity of primers employed for PCR-based diagnostics of Leishmaniases using multiple alignment analysis

Abstract

The purpose of this study was to assess the specificity of distinct primers used in the molecular diagnosis for Leishmania detection by using biological sequence search and alignment tools. Four primer pairs routinely employed in the PCR-based diagnostics for Leishmaniasis detection were evaluated through the software Primer-BLAST, which compares nucleotide sequences against user-selected database to avoid primer pairs cause non-specific amplifications. The LU5A-LB3C primer pair showed good specificity among all primers analyzed, generating alignments exclusively against distinct sequences of Leishmania species and no matches were found with other parasite species. Whereas the primer pairs designated MP3H--MP1L, B1-B2 and 13A-13B demonstrated matches against distinct sequences of Leishmania strains and other species, such as Rhesus monkey (Macaca mulatta) and starlet sea anemone (Nematostella vectensis). These findings emphasize the importance of selecting suitable primers for diagnosis of molecular diseases by conducting previous screenings in order to infer their specificity and identity against target templates within biological sequence annotation database.O objetivo deste estudo foi avaliar o grau de especificidade de oligonucleotídeos iniciadores empregados rotineiramente no diagnóstico molecular de Leishmania a partir de ferramentas de bioinformática. Quatro pares de oligonucleotídeos iniciadores foram analisados pelo programa Primer-BLAST, o qual permite comparar a especificidade dos iniciadores a partir de um banco de dados de sequências de DNA e, assim, evitar a possível presença de fragmentos não específicos nas reações de amplificação. O par de iniciadores LU5A-LB3C demonstrou boa especificidade em comparação aos demais iniciadores analisados, gerando alinhamentos que reconheceram exclusivamente fragmentos genômicos de Leishmania. Por outro lado, os pares de iniciadores MP3H-MP1L, B1-B2 e 13A-13B apresentaram alinhamentos compatíveis a fragmentos genômicos de distintas linhagens de Leishmania, além de reconhecer fragmentos genômicos não específicos, tais como de macaco Rhesus (Macaca mulatta) e uma espécie de anêmona (Nematostella vectensis). Esses resultados enfatizam a importância de efetuar análises prévias da especificidade de oligonucleotídeos iniciadores a fim de promover melhor desempenho e sensibilidade acurada nos métodos de diagnóstico molecular de doenças.Palavras-chave: Biologia computacional. Diagnóstico molecular. Identidade de oligonucleotídeos.