Functionalization of titanium with integrin-selective ligands for orthopedic and dental applications

Abstract

Despite being biocompatible and with adequate mechanical properties for application as a bone replacement material, titanium lacks osteoinductive capacity, i.e. it supports new bone growth on its surface but does not foster its formation. This may lead to failure of the implant due to poor osseointegration. Together with infection, this is in fact the main cause of failure of orthopedic and dental implants. Therefore, this thesis explores the possibility to convert titanium surface into a bioactive substrate, which is actively capable of influencing cell fate in vitro and enhance implant osteointegration in vivo.
 To install such bioactivity, surface chemical functionalization was chosen, since it allows for the modification of the external layer of the material, which is responsible for the interactions with the surrounding tissues, while leaving the bulk properties unaffected. Two families of extracellular matrix (ECM)-inspired integrin-binding biomolecules were tested. Integrins are the major cell surface receptor, whose main role is to mediate cell-surface interactions; thus, addressing these receptors could be beneficial to tune cell response to the surface. One type of biomolecule tested is a double-branched peptidic ligand that allows for the simultaneous presentation of the cell-adhesive RGD (Arg-Gly-Asp) motif and the synergic PHSRN (Pro-His- Ser-Arg-Asn) motif, which synergizes the RGD-mediated binding to integrin a5ß1. Alternatively, non peptidic integrin-selective ligands were tested as surface coating molecules. These highly stable ligands were designed by the group of Prof. Kessler at the Technische Universität München (TUM, Munich, Germany) to be selective for either integrins a5ß1 or avß3 and are introduced in a review paper included in the thesis. The role of both of these receptor subtypes in several bone biology events is currently matter of discussion in literature.
 Grafting of the ligands on titanium was either carried out via physisorption or chemical anchoring. Silanization was used to create a covalent bond between the synthetic molecules and the metallic oxide. Two cell types were used for the in vitro testing of the functionalization system: human osteoblast-like cells (SaOS-2) and mesenchymal stem cells. The testing of different combinations of biomolecule, grafting technique and cell type is the subject of the four full-papers reported in the thesis. Two of these papers also include the in vivo study of the effect of the chemical functionalization in an animal model.
 The thesis also includes a work focused on the merging of two surface modification techniques, namely chemical functionalization and topographical modification, to create a multifunctional titanium substrate that simultaneously addresses the problem of infection and poor osseointegration: the nanostructure of the topography acts as the bactericidal element, while the surface-grafted biomolecules give eukaryotic cell-instructive properties to the material. This work was carried out during a stay at the Centre for Cell Engineering at the University of Glasgow (Prof. Dalby, UoG, Glasgow, UK).
 Overall, the collection of works presented in the thesis delineates a comprehensive scenario of how chemical functionalization with ECM-inspired ligands can act as a powerful tool to tune cell behavior and, ultimately, guide the biological response at the peri-implant site. El objetivo principal de este proyecto de tesis es la instalación de bioactividad en la superficie de titanio para implantes ortopédicos y dentales a través de un proceso de funcionalización superficial. A pesar de ser biocompatible y con buenas propiedades mecánicas para substituir el tejido óseo dañado o ausente, el titanio carece de capacidades osteoinductivas, es decir, soporta pero no favorece los procesos de formación de hueso. Esto puede llevar a la fallida del implante debido a una falta de osteointegración. Las modificaciones superficiales permiten transformar la superficie bioinerte del titanio en una superficie bioactiva que estimula la producción de hueso, sin afectar las propiedades mecánicas del material. Para lograr dicha bioactividad, en este trabajo de tesis se inmovilizaron dos familias de moléculas peptidicas inspiradas en la matriz extracelular de las células que interactúan con las integrinas, los receptores celulares más importantes que transmiten la información entre las células y su matriz. El primer tipo de biomolécula testada es una molécula ramificada, cuyas dos extremidades llevan dos motivos peptídicos distintos: el motivo de adhesión celular RGD (Arg-Gly-Asp) y el motive de sinergia PHSRN (Pro-His-Ser-Arg-Asn), que incrementa la afinidad para la integrina a5ß1, muy relevante en procesos de crecimiento óseo. La segunda familia de biomoléculas abarca dos peptidomiméticos selectivos para la integrina a5ß1 o la integrina avß3, cuyo rol en la formación de hueso es también objeto de discusión en la literatura, y que fueron sintetizados por el grupo del Prof. H. Kessler de la Technische Universität München. Para la inmovilización de las moléculas en el titanio se utilizaron dos técnicas distintas: la fisisorción, que sólo está basada en la formación de enlaces débiles electrostáticos, puentes hidrogeno, etc., y la unión covalente, más estable, mediante la silanización de la superficie metálica. Las superficies de titanio modificadas se testaron con dos tipos celulares relevantes en el contexto de la substitución de material óseo: células de osteosarcoma (SaOS-2) y células mesenquimales (hMSCs), ambas de procedencia humana. La combinación de esos factores originó cuatro estudios, tres de los cuales son reportados como trabajos publicados. Dos de esos estudios incluyen también un análisis in vivo en un modelo animal, que permitió comprobar el efecto de la funcionalización en un escenario clínico real. Finalmente, se llevó a cabo un estudio en colaboración con el Prof. M. Dalby del Centre for Cell Engineering de la University of Glasgow para combinar la funcionalización química y la nanotopografia, obteniendo así una superficie de titanio multifuncional: las nanoestructuras superficiales son bactericidas, pero carecen de propiedades adhesivas, que pueden ser proporcionadas a través de la inmovilización de motivos peptídicos. En conjunto, los resultados de esta tesis demuestran que la funcionalización química es una herramienta poderosa para optimizar la respuesta celular en la superficie del biomaterial e inducir la respuesta biológica deseada.