Εισαγωγή: Η TDP-43 (TAR DNA-binding protein-43) πρωτεΐνη έχει πλέον αναγνωριστεί ως o μοριακός κρίκος, ο οποίος συνδέει πολλές από τις μέχρι πρόσφατα θεωρούμενες ξεχωριστές οντότητες νοσημάτων, που σήμερα συγκροτούν το φάσμα μετωποκροταφικής άνοιας / πλάγιας μυατροφικής σκλήρυνσης FTD/ALS. Η TDP-43 είναι το κύριο συστατικό των ουβικουιτινωμένων εγκλείστων που ανευρίσκονται τόσο στην FTD όσο και στην ALS. Η αιτιώδης συνάφεια της νευροεκφυλιστικής διεργασίας με την TDP‐43 πρωτεΐνη, προήλθε από την αναγνώριση παθογόνων μεταλλάξεων στο γονίδιο TARDBP, που την κωδικοποιεί, σε οικογένειες του φάσματος FTD/ALS. Εντούτοις, TDP‐43 πρωτεϊνοπάθεια έχει παρατηρηθεί και σε φορείς μεταλλάξεων και άλλων γονιδίων που σχετίζονται τόσο με την FTD όσο και με την ALS, αλλά και με άλλες νόσους, όπως μια μορφή της νόσου Alzheimer (AD), καταδεικνύοντας έτσι έναν γενικότερο καθοριστικό ρόλο της TDP‐43 στην νευροεκφυλιστική διεργασία. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της TDP‐43 πρωτεϊνοπάθειας και ειδικότερα: 1. Η μέτρηση των επιπέδων της TDP-43 πρωτεΐνης στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) ως υποψήφιος διαγνωστικός βιοδείκτης για το φάσμα FTD/ALS. 2. Η ανίχνευση γενετικών αλλαγών στο γονίδιο TARDBP, αλλά και σε άλλα γονίδια σχετιζόμενα ή όχι με TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια (C9οrf72, GRN, VCP κτλ.) και η αξιολόγηση της συνεισφοράς των γενετικών αλλαγών αυτών στον κλινικό φαινότυπο. 3. Η πιθανή συσχέτιση των γενετικών αλλαγών με τα επίπεδα της TDP-43 στο ΕΝΥ, αλλά και με τα επίπεδα των “κλασσικών” βιοδεικτών για την AD, δηλαδή την ολική πρωτεΐνη (τΤ), την φωσφορυλιωμένη μορφή αυτής (τΡ-181) και το β-αμυλοειδές πεπτίδιο με 42 αμινοξέα (Αβ42). Ασθενείς και Μέθοδοι: Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείται από 54 ασθενείς με FTD, 61 ασθενείς με ALS και 14 ασθενείς με FTD-ALS, οι οποίοι διαγνώστηκαν με τα πλέον πρόσφατα διαγνωστικά κριτήρια, υποστηριζόμενα από τους “κλασσικούς” βιολογικoύς δείκτες για την AD προκειμένου, ειδικά για την ομάδα FTD, να αποκλεισθεί η παρείσφρηση της μετωπιαίας και λογοπενικής παραλλαγής της AD. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των επίπεδων της TDP-43 και των κλασικών βιοδεικτών στο ΕΝΥ έγινε με μεθόδους ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας διπλού σάντουιτς [double-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Στους ασθενείς πραγματοποιήθηκε επίσης έλεγχος για τον εντοπισμό παθολογικών εξανουκλεοτιδικών επαναλήψεων (GGGGCC)n του γονιδίου C9orf72, με την μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και PCR με τη χρήση εκκινητών επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας (repeat-primed PCR), σε συνδυασμό με αυτοματοποιημένη ανάλυση τμημάτων DNA. Στους ασθενείς με απουσία παθολογικού αριθμού εξανουκλεοτιδικών επαναλήψεων πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση ολόκληρου του εξώματος (whole exome sequencing). Τα επίπεδα των βιοδεικτών συγκρίθηκαν με ομάδα ελέγχου 28 υγιών ατόμων, χωρίς νοητική ή κινητική διαταραχή και οι γενετικές αλλαγές με ένα ήδη πολύ καλά χαρακτηρισμένο δείγμα 81 νοητικά υγιών μαρτύρων από την Κρήτη. Επίσης, αναζητήθηκαν αλλαγές σε FTD/ALS γονίδια σε ένα πληθυσμό 100 με AD ασθενών με άνοια (AD τύπου) από την Κρήτη (Μελέτη Γήρανσης της Κρήτης). Αποτελέσματα: Στατιστικά σημαντικά υψηλότερες τιμές TDP-43 στο ΕΝΥ ανευρέθηκαν σε όλες τις ομάδες ασθενών (FTD, ALS, FTD-ALS), σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα TDP-43 των ασθενών με ALS ήταν αυξημένα σε σχέση με αυτά των ασθενών με FTD, ωστόσο αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα τT ανευρέθηκαν σε όλες τις ομάδες ασθενών, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, με τα επίπεδα των ασθενών με FTD να είναι αυξημένα σε σχέση με αυτά των ασθενών με ALS. Τα επίπεδα της τP-181 και του Αβ42 δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων ασθενών. Η ανάλυση ROC έδειξε ότι ο συνδυασμός των επίπεδων της TDP-43 στο ΕΝΥ με τις πρωτεΐνες T(tau), εκφραζόμενος με τον τύπο TDP-43×τT/τP-181 έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα (>80%), για τον διαχωρισμό ασθενών του φάσματος ALS/FTD από υγιείς μάρτυρες. Με την γενετική ανάλυση εντοπίστηκαν παθογόνες και πιθανά παθογόνες αλλαγές στο 18,6% (24/129) των ασθενών του φάσματος ALS/FTD. Τα γονίδια που εμφανίζονταν αυτές οι αλλαγές ήταν με φθίνουσα σειρά συχνότητας, τα γονίδια C9orf72, TARDBP, GRN, VCP, SOD1 και FUS. Η μέση ηλικία έναρξης της νόσου των ασθενών με παθολογική επέκταση εξανουκλεοτιδίου στο C9orf72 ήταν κατά 10 περίπου έτη μικρότερη σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς. Η p.Ile383Val TARDBP αλλαγή βρέθηκε και σε 2 ασθενείς διαγνωσμένους με άνοια στην Κρήτη. Εξετάζοντας τα επίπεδα της TDP-43, Aβ42, τΤ και τp-181 διαπιστώσαμε ότι οι φέροντες μετάλλαξη (επέκταση εξανουκλεοτιδίου) του C9orf72 γονιδίου ασθενείς με ALS (με ή χωρίς FTD), όπως και οι φορείς της συνώνυμης αλλαγής p.Asp285Asp στο γονίδιο MAPT, παρουσίαζαν στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα τΡ-181 σε σχέση με τους υπολοίπους ασθενείς. Επίσης, οι φορείς σπάνιων αλλαγών του APP είχαν χαμηλότερα επίπεδα Αβ42, σε σχέση με τους ασθενείς που δεν έφερες αντίστοιχες αλλαγές. Συμπεράσματα: Η TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια είναι νόσος με σημαντική κλινική και γενετική ετερογένεια. Εκφράζεται κυρίως στο προγεροντικό φάσμα ηλικιών και στον Ελληνικό πληθυσμό, εντούτοις γεροντική εμφάνιση αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο. Τα υψηλά επίπεδα της TDP-43 στο ΕΝΥ σε συνδυασμό με τις πρωτεΐνες T (tau) με τον τύπο TDP-43×τT/τP-181 έχουν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και ως εκ τούτου αποτελούν έναν εν δυνάμει βιοδείκτη της TDP-43 πρωτεϊνοπάθειας. Το πιο συχνό γονίδιο που συνδέεται με TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια στον Ελληνικό πληθυσμό είναι το C9orf72, με υψηλή συχνότητα 10,8% (14/129) σε σχέση με άλλους Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς και το οποίο φέρει την ηλικία έναρξης της νόσου 10 χρόνια νωρίτερα σε σχέση με τις σποραδικές μορφές. Η αλλαγή p.Ile383Val στο γονίδιο της TARDBP ίσως είναι πιο συχνή στον Ελληνικό πληθυσμό σε σχέση με άλλους πληθυσμούς και σε ασθενείς του γεροντικού φάσματος ηλικιών και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
