Genetically engineered horseradish peroxidase for facilitated purification from baculovirus cultures by cation-exchange chromatography

Levin, Gustavo Javier; Mendive, Fernando; Targovnik, Héctor M.; Cascone, Osvaldo; Miranda, Magdalena

doi:10.1016/j.jbiotec.2005.05.015

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“…3 A adição da cauda de histidina em proteínas recombinantes tem sido altamente efetiva, proporcionando a purificação da proteína alvo em uma única etapa com alto teor de pureza. 26 Como exemplos de proteínas recombinantes com cauda de histidina purificadas por IMAC em nível de bancada, podem-se citar pró-renina humana, 83 β-galactosidase e peroxidase de raiz forte 84,85 e, em nível industrial, a pró-insulina humana. 86 Pró-renina humana produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO), tendo uma cauda de 10 histidinas, foi purificada por IMAC, fazendo-se uso de colunas comerciais Talon ® -Co 2+ .…”

Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

“…83 Enzimas recombinantes como β-galactosidase e peroxidase de raiz forte com cauda de poli-histidina foram purificadas usando-se, respectivamente, agarose-dextrana-IDA-Zn 2+ e agarose-NTA-Ni 2+ , alcançando elevados níveis de pureza e recuperação. 84,85 A pró-insulina humana recombinante tendo uma cauda de histidina, produzida pela indústria brasileira BIOMM (Montes Claros, MG, Brasil) foi purificada por IMAC em géis de agarose-IDA-Ni 2+ , segundo procedimento descrito por Tikhonov e colaboradores. 86 Como os custos de recuperação e purificação de produtos chegam a representar uma porcentagem significativa do custo total, a minimização do número de etapas e do tempo do processo reduz enormemente o custo do produto.…”

Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

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Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Bresolin¹,

Miranda²,

Bueno³

2009

Quím. Nova

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Recebido em 16/7/08; aceito em 16/12/08; publicado na web em 11/5/09 IMMOBILIZED METAL-ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY (IMAC) OF BIOMOLECULES: FUNDAMENTAL ASPECTS AND TECHNOLOGICAL APPLICATIONS. Immobilized Metal Ion Affinity Cromatography -IMAC -is a group-specific based adsorption applied to the purification and structure-function studies of proteins and nucleic acids. The adsorption is based on coordination between a metal ion chelated on the surface of a solid matrix and electron donor groups at the surface of the biomolecule. IMAC is a highly selective, low cost, and easily scaled-up technique being used in research and commercial operations. A separation process can be designed for a specific molecule by just selecting an appropriate metal ion, chelating agent, and operational conditions such as pH, ionic strength, and buffer type.Keywords: immobilized metal-ion affinity chromatography; purification; biomolecules. INTRODUÇÃOOs princípios fundamentais da afinidade de biomoléculas por íons metálicos são conhecidos desde o início do século passado. Em 1974, Everson e Parker demonstraram que íons metálicos presentes em metaloproteínas são os principais responsáveis pela adsorção dessas em resinas contendo quelantes imobilizados e exploraram esta afinidade na separação deste tipo de proteínas. 1 A técnica proposta por Everson e Parker popularizou-se com o trabalho publicado por Porath e colaboradores em 1975, quando os autores introduziram o termo cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography -IMAC). 2 IMAC explora a interação entre espécies doadoras de elétrons presentes na superfície de biomoléculas em solução e íons metálicos quelatados imobilizados em um suporte sólido. Inúmeras são as aplicações analíticas, preparativas e industriais de IMAC, como a separação e purificação de diferentes biomoléculas (peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos), a separação de células a partir de extratos biológicos e estudos de estrutura-função de proteínas.Inicialmente a técnica de IMAC foi extensamente utilizada para purificação de biomoléculas contendo naturalmente grupos doadores de elétrons em resíduos de aminoácidos expostos na superfície (tais como o anel imidazol de histidina), os quais são primariamente responsáveis pela interação biomolécula-íon metálico. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi possível a incorporação de caudas (tag) em proteínas que não contêm naturalmente espécies doadoras de elétrons, tal como a fusão de sequência de seis histidinas na porção C ou N-terminal da proteína alvo, conferindo à mesma a possibilidade de purificação por IMAC. 3,4 Apesar de na literatura existirem excelentes artigos de revisão em inglês sobre IMAC 5-14 , nesta revisão, devido à intensa atividade neste campo, pretende-se abordar aspectos fundamentais, aplicações tecnológicas (escala de laboratório e industrial) e científicas com ênfase na purificação de proteínas nativas e recombinantes (com cauda de poli(histidina)). Dentre os aspectos fundamentais do mé...

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Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Bresolin¹,

Miranda²,

Bueno³

2009

Quím. Nova

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“…extensively studied member of the plant peroxidase superfamily [1]. This 308-amino acid enzyme is glycosylated at eight asparagine sites; it also contains a ferric heme prosthetic group and two calcium ions per molecule [2][3][4][5].…”

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confidence: 99%

Investigating the Structural and Functional Effects of Mutating Asn Glycosylation Sites of Horseradish Peroxidase to Asp

Asad

Khajeh

Ghaemi

2010

Appl Biochem Biotechnol

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Horseradish peroxidase (HRP) has long attracted intense research interest and is used in many biotechnological fields, including diagnostics, biosensors, and biocatalysis. Enhancement of HRP catalytic activity and/or stability would further increase its applications. One of the problems with heterologus expression of HRP especially in prokaryotic host is lack of glycosylation that affects it's stability toward H(2)O(2) and thermal inactivation. In this study, two asparagine residues which constitute two of the eight glycosylation sites in native HRP (Asn 13 and 268) with respectively 83% and 65% surface accessibility were substituted with aspartic acid in recombinant HRP. Both mutant proteins expressed in Escherichia coli showed increased stabilities against heat (increase in t (1/2) from 20 min in native rHRP to 32 and 67 min in N13D and N268D) and H(2)O(2) (up to threefold). Unexpectedly, despite the distance of the mutated positions from the active site, notable alterations in steady-state k (cat) and K (m) values occurred with phenol/4-aminoantipyrine as reducing substrate which might be due to conformational changes. No significant alteration in flexibility was detected by acrylamide quenching analyses, but ANS binding experiments purposed lesser binding of ANS to hydrophobic patches in mutated HRPs. Double mutation was non-additive and non-synergistic.

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“…We have subsequently modified the construction by including a 69 Arg tag at the 3 0 -end and the modified HRP-C gene was cloned into the pAcGP67 vector (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) This vector contains the glycoprotein 67 (GP67) leader peptide sequence, which targets the recombinant protein for secretion. The recombinant polh-AcHRP was previously constructed using the pAcGP67HRP and kept in our lab (Levin et al 2005). The pBacPak8 transfer vector was from BD Bioscience Clontech (Palo Alto, CA, USA).…”

Section: Insect Cells Virus Strains and Larvaementioning

confidence: 99%

“…AcHRP performance Expression levels of recombinant HRP-C achieved with polh? AcHRP in Sf9 cell cultures and R. nu larvae were compared with those obtained with polh-AcHRP (Levin et al 2005). Monolayers of 10 6 Sf9 cells in 6-well dishes were infected at an MOI of 2 pfu per cell in a 1.5 ml Sf900 II medium supplemented with 1% FCS either with polhAcHRP or polh?…”

Section: Optimisation Of Infection Conditions Of R Nu Larvaementioning

confidence: 99%

Rachiplusia nu larva as a biofactory to achieve high level expression of horseradish peroxidase

et al. 2011

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A process based on orally-infected Rachiplusia nu larvae as biological factories for expression and one-step purification of horseradish peroxidase isozyme C (HRP-C) is described. The process allows obtaining high levels of pure HRP-C by membrane chromatography purification. The introduction of the partial polyhedrin homology sequence element in the target gene increased HRP-C expression level by 2.8-fold whereas it increased 1.8-fold when the larvae were reared at 27 °C instead of at 24 °C, summing up a 4.6-fold overall increase in the expression level. Additionally, HRP-C purification by membrane chromatography at a high flow rate greatly increase D the productivity without affecting the resolution. The V(max) and K(m) values of the recombinant HRP-C were similar to those of the HRP from Armoracia rusticana roots.

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Genetically engineered horseradish peroxidase for facilitated purification from baculovirus cultures by cation-exchange chromatography

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Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Investigating the Structural and Functional Effects of Mutating Asn Glycosylation Sites of Horseradish Peroxidase to Asp

Rachiplusia nu larva as a biofactory to achieve high level expression of horseradish peroxidase

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