Highly sensitive sandwich immunoassay and immunochromatographic test for the detection of Clostridial epsilon toxin in complex matrices

Abstract

Epsilon toxin is one of the four major toxins of Clostridium perfringens. It is the third most potent clostridial toxin after botulinum and tetanus toxins and is thus considered as a potential biological weapon classified as category B by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). In the case of a bioterrorist attack, there will be a need for a rapid, sensitive and specific detection method to monitor food and water contamination by this toxin, and for a simple human diagnostic test. We have produced and characterized five monoclonal antibodies against common epitopes of epsilon toxin and prototoxin. Three of them neutralize the cytotoxic effects of epsilon toxin in vitro. With these antibodies, we have developed highly sensitive tests, overnight and 4-h sandwich enzyme immunoassays and an immunochromatographic test performed in 20 min, reaching detection limits of at least 5 pg/mL (0.15 pM), 30 pg/mL (0.9 pM) and 100 pg/mL (3.5 pM) in buffer, respectively. These tests were also evaluated for detection of epsilon toxin in different matrices: milk and tap water for biological threat detection, serum, stool and intestinal content for human or veterinary diagnostic purposes. Detection limits in these complex matrices were at least 5-fold better than those described in the literature (around 1 to 5 ng/mL), reaching 10 to 300 pg/mL using the enzyme immunoassay and 100 to 2000 pg/mL using the immunochromatographic test.

Strategies for the Development of Metallic‐Nanoparticle‐Based Label‐Free Biosensors and Their Biomedical Applications

“…[73] Immunoassay is am ethod of binding an antigen to an antibodyf or the recognition of ap athogen. [74][75][76] As showni nF igure 3, captured antibodies were immobilized on microplates following incubation and washing with blocking buffer to preventthe protein from reaching nonspecific sites. Different concentrations of the HIV p24 antigen were incorporated ontoc aptured antibody to which the biotinylated detector bound for interaction with the streptavidinconjugated AgNPs (FSN-SA) required for fluorescenced etection.…”

Clostridium perfringens – epidemiological importance and diagnostics

“…C. perfringens nie produkuje 13 z 20 podstawowych aminokwasów, a zapotrzebowanie zaspokaja przez rozkład tkanek gospodarza z udziałem produkowanych toksyn i enzymów (1). W gramie treści jelitowej zdrowego człowieka spotyka się 10 5 C. perfringens, a u osób z objawami zatrucia pokarmowego stwierdzano 10 7 jtk/g (18). Żywnością najczęściej zanieczyszczoną jest mięso i jego przetwory, rzadziej ryby, warzywa, produkty mleczne, żywność suszona czy przyprawy (4,59,70).…”

“…Jak dotąd opisano 20 toksyn C. perfringens (tab. 1), co sprawia, że jest on jednym z największych producentów toksyn wśród znanych mikroorganizmów (18,57). Toksyny te można podzielić na cztery kategorie, tj.…”

“…Należą do nich wysoka kontaminacja żywności lub paszy tym drobnoustrojem, nadmierne namnożenie drobnoustroju w przewodzie pokarmowym na skutek nagłej zmiany diety, przekarmienie, dieta wysokobiałkowa (1, 27), (19). Toksyna ε wywołująca zwykle choroby kóz i owiec uznawana jest za trzecią najniebezpieczniejszą toksynę wytwarzaną przez rodzaj Clostridium, po toksynie botulinowej i tężcowej, przez co została zaliczona do czynników bioterrorystycznych kategorii B (18). Toksyna ι jest przyczyną zachorowań bydła, owiec, królików i psów (19,56).…”

“…Określenie enterotoksyczności izolatów z kału lub żywności wymaga indukowania sporulacji szczepu w specjalnych podłożach stymulujących przetrwalnikowanie i produkcję toksyn jak bulion Ellnera, podłoża AEA czy Dunkan & Strong (16,33,39). Do wykrywania toksyny ε stosowane są przeciwciała mono-i poliklonalne, testy immunoenzymatyczne, test aglutynacji lateksowej i technika chromatografii cieczowej (18). W dochodzeniu epidemiologicznym zachorowań na tle C. perfringens stosowane są zarówno metody fenotypowe, jak i genotypowe.…”