Isolation and identification of metabolites from marine-derived actinobacteria

Abstract

Συστηματικές μελέτες που έχουν εστιάσει κατά κύριο λόγο σε βακτήρια που προέρχονται από το έδαφος έχουν καταδείξει τους μικροοργανισμούς σαν μία από τις πλουσιότερες πηγές βιοδραστικών μεταβολιτών με ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά και σημαντική φαρμακολογική δράση. Πολλοί μεταβολίτες μικροβιακής προέλευσης έχουν επιδείξει σημαντικά επίπεδα δραστικότητας σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμασιών, μεταξύ των οποίων είναι η αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, αντιιική και αντικαρκινική δράση. Χρησιμοποιούνται ευρέως σαν θεραπευτικοί παράγοντες στην ιατρική, κτηνιατρική, σαν αγροχημικά και πολύ συχνά αποτελούν μόρια-οδηγούς για την σύνθεση ή ημισύνθεση ανάλογων χημικών μορίων. Οι θαλάσσιας προέλευσης μικροοργανισμοί αντιπροσωπεύουν μια ιδιαίτερη και παράλληλα ελάχιστα μελετημένη πηγή βιοδραστικών μεταβολιτών. Μεταξύ των θαλάσσιας προέλευσης μικροοργανισμών, τα ακτινοβακτήρια εμφανίζονται ως τα πλέον παραγωγικά όσο αφορά την βιοσύνθεση βιοδραστικών μεταβολιτών με πρωτότυπες χημικές δομές. Στελέχη αυτής της ταξινομικής ομάδας συχνά απαντώνται και στο έδαφος και έχουν παρουσιάσει εξαιρετική ικανότητα παραγωγής κλινικά σημαντικών αντιβιοτικών ουσιών. Καθώς το θαλάσσιο περιβάλλον είναι σημαντικά διαφοροποιημένο από το χερσαίο είναι αναμενόμενο τα θαλάσσιας προέλευσης ακτινοβακτήρια να παράγουν βιοδραστικά μόρια με ιδιαίτερες χημικές δομές. Στα πλαίσια της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, ένας αριθμός από βακτηριακά στελέχη θαλάσσιας προέλευσης, από την τράπεζα στελεχών του Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών καλλιεργήθηκε σε μικρής κλίμακας υγρές καλλιέργειες και τα οργανικά εκχυλίσματα που προέκυψαν αξιολογήθηκαν ως προς το χημικό τους προφίλ με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Μεταξύ αυτών, το στέλεχος BI0048, το οποίο είχε απομονωθεί ως ενδοφυτικό βακτήριο από το ροδοφύκος Laurencia glandulifera, εμφάνισε το πλέον ενδιαφέρον χημικό προφίλ και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Το ενδοφυτικό αυτό στέλεχος, το οποίο ταυτοποιήθηκε ως Streptomyces ambofaciens, καλλιεργήθηκε σε μεγάλη κλίμακα σε κωνικές φιάλες με θρεπτικό μέσο βασισμένο σε θαλασσινό νερό. Οι καλλιέργειες επωάσθηκαν στους 37 °C για 8 ημέρες με τις κωνικές φιάλες σε σταθερή ανάδευση 130 rpm επί κινούμενης τράπεζας. Μετά το πέρας της καλλιέργειας, προστέθηκε σε κάθε κωνική φιάλη ρητίνη Amberlite XAD-7HP ώστε να προσροφήσει τους εξωκυτταρικούς μεταβολίτες και ακολούθως το θρεπτικό μέσο και η ρητίνη παρέμειναν υπό ανακίνηση σε χαμηλή ταχύτητα για 12 ώρες. Η ρητίνη και τα κύτταρα διηθήθηκαν από ηθμό πολλαπλών στρωμάτων γάζας και το ίζημα εκπλύθηκε με απιονισμένο νερό για την απομάκρυνση των αλάτων. Στην συνέχεια, η ρητίνη και η κυτταρική βιομάζα εκχυλίσθηκαν εξαντλητικά με ακετόνη. Η διήθηση του εκχυλίσματος και στην συνέχεια η εξάτμιση των διαλυτών υπό κενό σε θερμοκρασία μικρότερη των 40 °C απέδωσε στερεό υπόλειμμα το οποίο υποβλήθηκε σε πολλαπλούς χρωματογραφικούς διαχωρισμούς με κανονικής και αντίστροφης φάσης χρωματογραφία με υποβοήθηση κενού, χρωματογραφία στήλης βαρύτητας και HPLC που οδήγησαν στην απομόνωση ενός σημαντικού αριθμού μεταβολιτών σε καθαρή μορφή. Ο δομικός χαρακτηρισμός των απομονωμένων μεταβολιτών βασίσθηκε στην ανάλυση των φασματοσκοπικών τους δεδομένων που ελήφθησαν από Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), Φασματομετρία Μάζας (MS), Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR) και Φασματοσκοπία Υπεριώδους-Ορατού (UV-Vis) και την σύγκριση τους με αντίστοιχα δεδομένα δημοσιευμένων μεταβολιτών που παρουσίαζαν δομικές ομοιότητες. Συνολικά από το οργανικό εκχύλισμα του ακτινοβακτηριακού στελέχους BI0048 απομονώθηκαν 23 μεταβολίτες, μεταξύ των οποίων 10 πολυκετίδια (1-10), τέσσερεις απλοί αρωματικοί μεταβολίτες (11-14), επτά δικετοπιπεραζίνες (15-21), ένας νουκλεοσίδης (22) και ένας μεταβολίτης (23) με μεθακρυλική ομάδα. Συγκεκριμένα, τα πολυκετίδια που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν ως η εντεροσίνη (1), η οποία επίσης έχει αναφερθεί και ως βουλγαμυκίνη, η 5-δεοξυ-εντεροσίνη (2), η γαϊλουπεμικίνη D (3), η γαϊλουπεμικίνη Ε (4), η ζουμπερικίνη A (5), η ζουμπερικίνη Β (6), η γερμισιδίνη A (7), η γερμισιδίνη Β (8), η γερμισιδίνη Κ (9) και η γερμισιδίνη L (10). Εξ αυτών, τέσσερεις μεταβολίτες είναι νέα φυσικά προϊόντα (5, 6, 9 και 10). Όλα τα πολυκετίδια που απομονώθηκαν έχουν στον σκελετό τους α-πυρανικό δακτύλιο που αποτελεί σημαντικό στοιχείο του φαρμακοφόρου τμήματος πολλών φυσικών και συνθετικών βιοδραστικών μορίων. Φυσικά προϊόντα που διαθέτουν α-πυρανικό δακτύλιο συχνά διαδραματίζουν ρόλους χημικής προστασίας για τους οργανισμούς που τους παράγουν, όπως επίσης πολύ συχνά εμφανίζουν αντιβακτηριακές, αντιμυκητιακές, αντιιικές, κυτταροτοξικές, φυτοτοξικές και νευροτοξικές ιδιότητες. Οι αρωματικοί μεταβολίτες που απομονώθηκανταυτοποιήθηκαν ως το βενζοϊκό οξύ (11), το υδροκινναμικό οξύ (12), το (E)-κινναμικό οξύ (13) και η τυροσόλη (14), η οποία επίσης ονομάζεται p-υδροξυ-φαινυλο-αιθανόλη. Οι δικετοπιπεραζίνες που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν ως η cis-cyclo(L-Pro-L-Ala) (15), η cis-cyclo(L-Pro-L-Val) (16), η cis-cyclo(L-Pro-L-Leu) (17), η cis-cyclo(L-Pro-L-Ile) (18), η cis-cyclo(L-Pro-L-Phe) (19), η trans-cyclo(L-Pro-L-Phe) (20) και η cis-cyclo(L-Pro-L-Tyr) (21). Επιπλέον, ο νουκλεοσίδης που απομονώθηκε ταυτοποιήθηκε ως η αδενοσίνη (22), ενώ ο μεταβολίτης 23 περιείχε μία μεθακρυλική ομάδα. Οι μεταβολίτες 1–10 αξιολογήθηκαν ως προς την αντιβακτηριακή τους δράση έναντι του επιδημικού, ανθεκτικού στην μεθυκιλλίνη, στελέχους EMRSA-15 και του πολυανθεκτικού στελέχους SA1199B του Staphylococcus aureus, καθώς επίσης και έναντι του στελέχους NCTC-10418 της Escherichia coli. Επίσης, η κυτταροτοξική δράση των μεταβολιτών 1–10 αξιολογήθηκε έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών MCF7 (αδενοκαρκίνωμα στήθους) και A549 (καρκίνωμα πνεύμονα). Παρ’ όλα αυτά, οι μεταβολίτες 1–10 δεν επέδειξαν αξιοσημείωτη δραστικότητα σε καμία από τις δύο βιοδοκιμές.