Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Abstract

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1 . Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1 . Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1 . Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

Calpain2 mediates Rab5-driven focal adhesion disassembly and cell migration

“…4,24 The fluorogenic substrate tBOC-LM-CMAC is a cell-permeable molecule that fluoresces upon cleavage of L-leucyl-Lmethionine linker, which attaches a tBOC quencher. [24][25][26] A549 cells were incubated with the substrate for different periods of time and then samples were fixed and mounted, to measuring the fluorescence intensity by microscopy. Accordingly, shRNA-control cells showed a time-dependent increase in fluorescence intensity.…”

Calpains: general characteristics and role in various states of the organism

“…Їх активність регулюється шляхом зміни концентрації Ca 2+ та кальпастатину -їх ос новного інгібітору. За допомогою протеолізу субстратів вони відіграють важливу роль у ши рокому спектрі біологічних явищ [5], здійснюють обмежене розщеплення протеїнівмішеней у відповідь на кальційзалежну сигналізацію [4,8,9] та продукують не короткі пептиди або амінокислоти, а великі поліпептидні фрагменти [2].…”

“…Вміст мРНК і кількість протеїну слабо ко релюють з активністю кальпаїнів, обмежуючи використання генетичних методів або виміру їх концентрації [8]. Використання похідної пропіонової кислоти, пов'язаної з казеїном у співвідношенні 8:1 моль або вище, може за безпечити аналіз протеолітичної активності кальпаїнів [16].…”

“…Токсичність надмірного надходження Ca 2+ сприяє по шкодженню нейронів після інсульту, трав ми, судоми [6]. Кальпаїни задіяні в розвитку м'язової дистрофії, раку, хворобі альцгеймера і розсіяного склерозу [8,9]. При цьому виділяють…”

“…але разом з тим вони приваблюють дослідників як потенційні фактори в терапев тичних процедурах [28]. Регуляція діяльності кальпаїнів є складним і не до кінця зрозумілим процесом [8]. Тому останнім часом особливу увагу приділяють вивченню клінічного значен ня активації кальпаїнів [4].…”