New Perspectives on the Determination of Phosphatase Activity in Ectomycorrhizae of Nothofagus Obliqua Forests in Southern Chile

Abstract

We present a method to localise and quantify surfacebound phosphatase activity (SBPA) in mycorrhizal fungi and mycorrhizae of Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst., using image processed confocal fluorescent microscopy. ELF-97 is a hydrophilic substrate which turns into a strongly fluorescent precipitate upon activation by phosphomonoesterases. In fungal mycelium, this technique has recently been approved by comparison with a standard method (p-nitrophenyl-phosphate). The microscopic technique based on ELF-97 revealed that Paxillus involutus (Batsch: Fr.) Sing. and Austropaxillus boletinoides (Sing.) Brsky. & Jarosch provide different adaptive strategies to changing phosphate concentrations and different pH (3-7). We also analysed SBPA in four mycorrhizal associations of N. obliqua and found that the organisation of the mantle played an essential role regarding the SBPA. In general, mycorrhizal roots shifted SBPA from the root to the mantle. In this context, Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch proved to be the most relevant mycorrhiza partner for N. obliqua by increasing significantly the overall SBPA of the mycorrhiza in respect to non-mycorrhizal roots. In conclusion, ELF-97 fluorescence microscopy in combination with image processing routines determined SBPA and revealed phosphorus (P) adaptation strategies of mycorrhizal fungi and mycorrhizae on a structuralphysiological level.KEYWORDS: Confocal microscopy, ectomycorrhizae of Nothofagus obliqua, ELF-97, phosphatase activity, quantitative fluorescence microscopy. RESUMENNosotros presentamos un método basado en la microscopía confocal de fluorescencia y en el análisis de imágenes, para localizar y cuantificar la actividad de la fosfatasa superficial (SBPA) en hongos ectomicorrícicos y en ectomicorrizas de Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst. El sustrato ELF-97 es hidrofílico, el cual se desarrolla en un precipitado altamente fluorescente bajo su activación a través de fosfomonoesterasas. Recientemente esta técnica ha sido aprobada mediante comparaciones con un método estándar (fosfato de pnitrofenilo) realizadas en micelio fúngico. La técnica microscópica con ELF-97 reveló que Paxillus involutus (Batsch: Fr.) Sing. y Austropaxillus boletinoides (Sing.) Brsky. & Jarosch poseen diferentes estrategias de adaptación frente a distintas concentraciones de fosfatos y pH (3-7). Nosotros analizamos la SBPA en cuatro asociaciones micorrícicas de N. obliqua y encontramos que la organización del manto juega un rol esencial con respecto a la SBPA. En general, las raíces micorrizadas transfieren la SBPA de la raíz hacia el manto. En este contexto, Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch demostró ser el hongo ectomicorrícico más relevante para N. obliqua, al incrementar significativamente el 42 Gayana Bot. 60(1), 2003 total de la SBPA de la micorriza en relación a la raíz sin micorrizar. En conclusión, a través de la microscopía confocal de fluorescencia basada en el sustrato ELF-97 y su combinación con el procesamiento de imágenes es posible, tanto en hongos mi...