A potabilidade da água para o consumo humano influencia a saúde e a qualidade de vida das populações. As nascentes representam a principal fonte de abastecimento das famílias do Assentamento Florestan Fernandes (AFF), localizado no Sul do Estado do Espírito Santo. Todavia, a supressão das florestas nativas do AFF e ausência de proteção recomendada colocam em risco a conservação e perenidade das nascentes, e podem comprometer a potabilidade da água. O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade das águas de nascentes com diferentes características ambientais no AFF. Selecionou-se oito nascentes e realizou-se coletas periódicas e análises laboratoriais para avaliar os parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água. Ademais, foi calculado o Índice de Impacto Ambiental em Nascentes (IIAN), para identificar o grau de impacto ambiental na área de contribuição de cada nascente. Os resultados dos parâmetros de qualidade da água, mostraram que há inconformidade com a Portaria de consolidação nº5/2017 do Ministério da Saúde e Resolução do CONAMA 357/05. O IIAN mostrou que 25% das nascentes foram enquadradas como “bom”, 37,5% como “Razoável, outras 25% classificadas como “ruim” e 12,5% como “Péssimo”. Concluiu-se que o uso e ocupação do solo, bem como seu manejo influenciam na qualidade da água.