Real-time PCR for traceability and quantification of genetically modified seeds in lots of non-transgenic soybean

Abstract

The constant presence of genetically modified (GM) soybean in conventional seed lots has become a growing problem for international seed trade. In this context, seed companies have prompted the development of routine tests for accurate genetically modified soybean seeds detection. In this study, a quantitative PCR-based method was standardized in order to detect and quantify mixtures of seeds (i.e. certified seed) or GM grains (i.e. seeds came from field) into samples of non-GM soybean, in a way that soybean lots can be assessed within the standards established by legislation. The method involved the use of p35S-f2/petu-r1 primers targeting CP-4 enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (cp4-epsps) gene (i.e. that confers herbicide tolerance in Roundup Ready TM (RR)) for real-time PCR detection and quantification through mericon Quant GMO Detection Assay. The results revealed the method efficiency to detect and quantify the presence of even one soybean seed in batch used for routine evaluation of GM seeds. In addition, it was possible to detect of up to 0.1% of transgenic DNA relative to the soybean grains content. Thus, the sensitive GMO quantitative approach described in this study will provide support in supervising activities, and facilitate the process and control of GM soybean.

Determinación de transgenicidad y verificación en el etiquetado de alimentos industrializados de maíz en centros de expendio de Lima metropolitana

“…Para seleccionar la técnica que permita detectar secuencias transgénicas en alimentos se debe considerar: viabilidad, sensibilidad, exactitud, reproducibilidad, practicidad, rapidez y costo. Actualmente los métodos moleculares son los más aceptados, entre ellos se considera que la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (Real time-PCR) es la más adecuada, tanto para detectar secuencias transgénicas, como para cuantificar su concentración (10,11) .…”

“…Por ello, el método de extracción y purificación de ADN total de los alimentos es un paso crítico para la detección de secuencias de ADN transgénicas. Utilizar el procedimiento establecido en el kit Dneasy Mericon Food y verificar la calidad de la extracción con el kit de detección Mericon Screen 35S, mediante la técnica de Real time-PCR, permite obtener gran cantidad de ADN idéntico al de partida y también detectar trazas de secuencias transgénicas (11) . El P35S es un promotor fuerte que se utiliza para asegurar la expresión del transgene en la mayoría de las plantas cultivadas comercializadas; el ser una secuencia transgénica universal permite lograr un amplio espectro de detección de organismos genéticamente modificados (OGM) y ha demostrado ser útil en la detección de productos alimenticios que tienen componentes transgénicos (14) .…”

Detección del promotor 35S mediante PCR tiempo-real: indicador de transgenicidad en alimentos y Gossypium sp.

“…En el 2018 se cultivaron doce CGM en veintiséis países (ISAAA, 2018).Como consecuencia del incremento global del área dedicada a CGM y sus derivados, los organismos reguladores de distintos países han promovido la necesidad de monitorear su presencia mediante técnicas eficientes a nivel de laboratorio (Pierboni et al, 2016;Eckerstorfer et al, 2019). Aproximadamente sesenta países poseen normativas para el etiquetado de productos que contienen trazas de organismos genéticamente modificados (OGM) que excedan los estándares establecidos por su propia legislación (Leão-Buchir et al, 2018). En Europa se dispuso un valor de 0,9 % de trazas de OGM (Bonfini et al, 2001; Kamle y Ali, 2013; Randhawa et al 2016; Wei et al, 2018), en Brasil de 1 % (Randhawa et al, 2016); mientras que en Tailandia, Corea y Japón el límite es de 5 % (Randhawa et al, 2016).En Centroamérica la situación es poco uniforme.…”

“…Actualmente, se emplean diversos métodos para detectar trazas de OGM presentes en plantas y alimentos procesados, entre los cuales se encuentran los ensayos basados en proteínas, como el ELISA (Freitas et al, 2016;Yeaman et al, 2016), así como las técnicas enfocadas en la detección cualitativa de ADN transgénico por PCR punto final o cuantitativa por PCR tiempo real (qPCR) (Kamle y Ali, 2013), este último método es considerado como estándar, debido a su elevada especificidad y sensibilidad (Leão-Buchir et al, 2018).…”

“…La detección por PCR en tiempo real, tanto cualitativa como cuantitativa, se basa en la identificación de secuencias específicas exógenas, como promotores, terminadores y secuencias codificantes presentes en los eventos transgénicos (Barbau-Piednoir et al, 2010;2012). Los elementos recombinantes más comúnmente encontrados en los cultivos GM son el promotor 35S (p-35S) del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador nopalina sintasa (t-NOS); ambas secuencias son reguladoras de la transcripción y forman parte de los constructos de la mayoría de los eventos aprobados para su comercialización internacional, siendo estos indicadores de material vegetal y alimentos procesados que contienen ADN recombinante (Datukishvili et al, 2015;Pierboni et al, 2016;Carvajal et al, 2017;Leão-Buchir et al, 2018).…”