Recent advances in engineering nonribosomal peptide assembly lines

Abstract

Nonribosomal peptides are amongst the most widespread and structurally diverse secondary metabolites in nature with many possessing bioactivity that can be exploited for therapeutic applications. Due to the major challenges associated with total- and semi-synthesis, bioengineering approaches have been developed to increase yields and generate modified peptides with improved physicochemical properties or altered bioactivity. Here we review the major advances that have been made over the last decade in engineering the biosynthesis of nonribosomal peptides. Structural diversity has been introduced by the modification of enzymes required for the supply of precursors or by heterologous expression of tailoring enzymes. The modularity of nonribosomal peptide synthetase (NRPS) assembly lines further supports module or domain swapping methodologies to achieve changes in the amino acid sequence of nonribosomal peptides. We also review the new synthetic biology technologies promising to speed up the process, enabling the creation and optimisation of many more assembly lines for heterologous expression, offering new opportunities for engineering the biosynthesis of novel nonribosomal peptides.

Recent Advances in Genetic Manipulation of Organisms for the Production of Nonribosomal Peptides

“…Esta técnica começou a ser aplicada no final da década de 1960 e consistia na inserção de mutações em linhagens selvagens, com a finalidade de inativar algumas vias metabólicas e aumentar a aceitação por precursores diferentes aos naturais e, assim, biossintetizar novos compostos. 60,67,68 A chegada da era pós-genômica permitiu a introdução de novas técnicas de biologia molecular para a geração de mutações genéticas dirigidas (e não somente aleatórias, como inicialmente), consequentemente a mutassíntese teve uma reformulação total do desenho dos experimentos. De igual importância neste ressurgimento é o avanço da síntese orgânica convencional que permite hoje ter acesso a um maior número de reagentes com alta pureza enantiomérica para serem usados como precursores não-naturais.…”

“…A busca e obtenção de novos fármacos de origem natural têm sido abordadas de forma mais rápida e eficiente através da integração das diversas tecnologias que surgiram a partir da era genômica e, mais recentemente, devido à i orporação de outras i as , como a metabolômica, metagenômica e proteômica, assim como diversas ferramentas de bioinformática, tais como antiSmash, 11 NRPSpredictor, 12 MIBiG, 13 RAST, 14 Smurf, 15 para busca e caracterização 60,62 A motivação em se produzir compostos análogos biossínteticos aos NRPs é que aumenta a quantidade de metabólitos diferentes que podem ser produzidos com estruturas alteradas, esclarecendo por exemplo dúvidas em relação a estruturaatividade que é essencial para o desenvolvimento de fármacos e compostos relevantes. Outro motivo é que existe a alta incidência de re-isolamento de substâncias já conhecidas quando se faz prospecções de diversos organismos, o surgimento dessas bibliotecas é uma forma de inibir a repetição dessas estruturas.…”

“…91,92 Deste modo, foi possível identificar 3 compostos bromo-alterocromidas, além de estabelecer uma estratégia inovadora para a identificação e caracterização de novos peptídeos não ribossomais aproveitando as vantagens da captura de clusters de genes mediante TAR e de utilizar o sistema de expressão em E. coli, organismo hospedeiro versátil e de fácil manipulação genética (Figura 6). 60,90 Figura 6. Representação do sistema TAR e posterior expressão em E. coli para a identificação dos compostos bromoalterocromida A e B e alterocromida B.…”

Natural Products Remain an Important Source for Drug Development in the Post-Genomic Era

“…With the advance in synthetic biology and genome engineering technologies, it becomes rational and possible to obtain produce key precursors and the core scaffolds exploiting rational engineering of biosynthetic pathways. [21][22][23][24] On this basis, increasing attention have been paid to modular PKS/NRPS megaenzymes 25,26 for rational production of complex PK/NRP scaffolds. It was reported firstly by Christian Hertweck et al 26 that the reprogrammed modular (type I) aur polyketide synthase was successful in generating luteoreticulin through rational genetic recombination and domain exchanges.…”

“…Combinatorial biosynthesis of target products is a relatively much more sophisticated process including many successive procedures. In brief, it contains 6 main steps: 24 sequencing and bioinformatic analysis, selection of heterologous expression hosts, DNA assembly, refactoring pathways, improved selection of mutants and genome editing.…”