Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

Ботезату, И. В.; Панчук, И О; Строганова, А. М.; Сендерович, А. И.; Кондратова, В. Н.; Шелепов, В. П.; Lichtenstein, A. V.

doi:10.2144/000114515

Cited by 11 publications

(16 citation statements)

References 21 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Ранее мы показали, что флуоресцентные зонды TaqMan в дополнение к уже известным их функциям (мониторингу в реальном времени ПЦР и плавления ДНК) также мо-гут служить блокирующими агентами, избирательно подавляющими амплификацию аллелей дикого типа. Основанный на этом наблюдении протокол «обогащенной» ПЦР-DMA обеспечивает значительное повышение чувствительности мутационного сканирования генов NRAS и BRAF [21]. Достигнутый уровень чувствительности этого подхода позволял надеяться на его применимость в качестве экспресс-метода жидкостной биопсии.…”

Section: Introductionunclassified

“…Асимметричная «обогащенная» ПЦР-DMA (субоптимальные условия) [21]. Образцы ДНК анализировали в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США), как описано ранее [21], с некоторыми модификациями. Инкубационная смесь (25 мкл) содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 8,8); 50 мМ KCl; 0,01 % Tween-20; 3 мМ MgCl 2 ; 0,25 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,2 × EvaGreen (Biotium, США); прямой и обратный праймеры в соотношении 1:15 или 15:1 (т. е.…”

Section: Introductionunclassified

“…В стандартных (оптимальных) условиях ПЦР незначительные различия в стабильности комплексов зонд/аллель не оказывают заметного влияния на ход реакции, однако в специально подобранных субоптимальных условиях (снижение концентрации фермента и температуры отжига, присутствие в инкубационной среде обоих зондов, укороченные циклы амплификации) эти различия становятся существенными, что позволяет дискриминировать интактные и мутантные аллели. Разработанный на этой основе прием «обогащения» значительно повышает чувствительность мутационного сканирования генов BRAF и NRAS, как показано нами ранее [21]. В данном исследовании «обогащенную» ПЦР-DMA применили для мутационного сканирования KRAS.…”

Section: Introductionunclassified

See 3 more Smart Citations

Target liquid biopsy using “enriched” polymerase chain reaction and DNA melting analysis

Ботезату¹,

Панчук²,

Коломейцева³

et al. 2018

Usp. mol. onkol

View full text Add to dashboard Cite

1 НИИ канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2 НИИ клинической онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Анатолий Владимирович Лихтенштейн alicht@mail.ru Цель исследования -оценка возможности применения высокочувствительного метода «обогащенной» полимеразной цепной реакции c последующим анализом плавления ДНК (DNA melting analysis) (ПЦР-DMA) для таргетной жидкостной биопсии у онкологических больных. Материалы и методы. Метод ПЦР-DMA использовали для мутационного сканирования онкогена KRAS (кодоны 12 и 13) в опухолевой ткани и в плазме крови 20 больных колоректальным раком. Результаты. Активированный онкоген обнаружен у 16 больных в самой опухоли и у 5 из них -в плазме крови (подтверждено секвенированием). В опухоли и плазме крови еще 2 больных при «обогащенной» ПЦР-DMA выявлено присутствие мутантных аллелей, но в крайне низкой концентрации, не позволявшей их идентифицировать методом Сэнгера. Таким образом, таргетная жидкостная биопсия в предлагаемом варианте оказалась успешной у 7 (~35 %) из 20 исследованных больных. С учетом того факта, что анализ плазмы крови пациентов проводили после многократных лечебных процедур, вызывающих массовую гибель опухолевых клеток, реальная эффективность данного метода может оказаться существенно выше. Ключевые слова: жидкостная биопсия, сканирование мутаций, плавление ДНК, KRAS Для цитирования: Ботезату И. В., Панчук И. О., Коломейцева А. А. и др. Таргетная жидкостная биопсия посредством «обогащенной» полимеразной цепной реакции и анализа плавления ДНК. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(1):35-42. Objective: to evaluate the possibility of using a highly sensitive method of "enriched" polymerase chain reaction followed by DNA melting analysis (PCR-DMA) for target liquid biopsy of cancer patients. Materials and methods. The "enriched" PCR-DMA was used for mutation scanning of KRAS (codons 12 and 13) in tumor and blood plasma of 20 patients with colorectal cancer. Results. Activated oncogene was found in tumor tissue of 16 patients and in blood plasma of 5 patients (confirmed by sequencing). Mutant KRAS alleles were also found in tumor and plasma of another 2 patients, but in very low concentrations that did not allow their validation by Sanger sequencing. Thus, in our study the target liquid biopsy was successful in ~35 % patients. Since the plasma tests were carried out after repeated medical procedures causing mass death of tumor cells, the actual efficiency of this approach may appear significantly higher. For citation: Botezatu I. V., Panchuk I. O., Kolomeytseva A. A. et al. Target liquid biopsy using "enriched" polymerase chain reaction and DNA melting analysis. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(1):35-42.

show abstract

Section: Introductionunclassified

See 2 more Smart Citations

Target liquid biopsy using “enriched” polymerase chain reaction and DNA melting analysis

Ботезату¹,

Панчук²,

Коломейцева³

et al. 2018

Usp. mol. onkol

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…В наших предыдущих исследова-ниях было показано, что зонды TaqMan могут быть использованы не только для мониторинга полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) и сканирования мутаций посредством DMA, но и в качестве блокирующих амплификацию агентов. Это позволило проводить «обогащенную» ПЦР мутантных аллелей и примерно в 10 раз повы-сить чувствительность их обнаружения [6].…”

Section: Introductionunclassified

Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis

et al. 2017

View full text Add to dashboard Cite

Введение Таргетная терапия онкологических заболеваний основана на предварительных исследованиях ключе-вых для определенной формы рака молекулярных по-казателей, в качестве которых наиболее часто высту-пают дефекты протоонкогенов и генов-супрессоров. Один из наиболее значимых объектов генодиагности-ки -онкоген KRAS, мутации которого в кодонах 12, 13 и 61 встречаются в ~ 40 % случаев рака толстой кишки [1] и прогнозируют негативный ответ на терапию ан-ти-EGFR (epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста). Однако выявление генных мутаций зачастую осложняется рядом обстоя-тельств: 1) ограниченным количеством образца ДНК; 2) длительностью и стоимостью анализа, затратами труда и реактивов; 3) низким содержанием мутантных аллелей в исследуемом образце ДНК [2]. Критиче-ски важной в этой ситуации является возможность надежного, быстрого и экономичного сканирования генных мутаций.В наибольшей степени удовлетворяет этим тре-бованиям метод плавления ДНК (DNA melting analysis, DMA) с использованием гидролизуемых зондов TaqMan. Он прост в исполнении, производителен, экономичен и, кроме того, реализуется в «закрытом формате», исключающем перекрестное загрязнение образцов [3][4][5]. В наших предыдущих исследова-ниях было показано, что зонды TaqMan могут быть использованы не только для мониторинга полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) и сканирования мутаций посредством DMA, но и в качестве блокирующих амплификацию Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК

show abstract

Asymmetric mutant-enriched polymerase chain reaction and quantitative DNA melting analysis of KRAS mutation in colorectal cancer

Ботезату

Кондратова

Шелепов

et al. 2020

Analytical Biochemistry

View full text Add to dashboard Cite

Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

Cited by 11 publications

References 21 publications

Target liquid biopsy using “enriched” polymerase chain reaction and DNA melting analysis

Target liquid biopsy using “enriched” polymerase chain reaction and DNA melting analysis

Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis

Asymmetric mutant-enriched polymerase chain reaction and quantitative DNA melting analysis of KRAS mutation in colorectal cancer

Contact Info

Product

Resources

About