Testes De Gradiente De Temperatura Com Primers Issr Em Acessos De Milhos Crioulos Prospectados No Norte De Minas Gerais

Abstract

Introdução: Dentre os marcadores de DNA baseados em PCR para estudos de diversidade, destaca-se o ISSR (Inter Simple Sequences Repeats), o qual apresenta vantagens como baixo custo relativo, alta reprodutibilidade e dispensa quanto aos conhecimentos prévios dos genomas. Objetivos: Estudar a otimização das condições de amplificação via PCR (gradientes de temperaturas de anelamento), envolvendo primers ISSR e os genomas de acessos de milhos crioulos (Zea mays L.) oriundos do Norte de Minas Gerais. Material e métodos: As extrações de DNAs seguiram um protocolo CTAB adaptado, utilizando-se folhas maduras de milhos crioulos. Para otimização das amplificações com primers ISSR (Coleção UCB, Canada), foram realizados testes de gradientes de temperaturas de anelamentos em termociclador configurado para o espectro de 45ºC a 65ºC, gerando 12 temperaturas dentro deste intervalo. As reações seguiram a seguinte programação: uma fase inicial de desnaturação a 94ºC por 5 min; seguida por 35 ciclos de [desnaturação (94ºC por 1 min), anelamento (45ºC a 65ºC por 1 min) e extensão (72ºC por 2 minutos)]; e uma fase de extensão final de 72ºC por 7 min / conservação a 4°C. Utilizou-se DNA's de dois indivíduos escolhidos em uma coleção de 44 acessos, variando-os a cada teste. Na placa de PCR (96 poços), testou-se quatro primers por reação, tendo as linhas como variantes de genótipos e primers; e colunas quanto às diferentes temperaturas. Resultados: Durante a execução do estudo, foram testados 56 primers ISSR, sendo que 34 deles caracterizam-se como sendo amplamente polimórficos, sob temperaturas de anelamento específicas identificadas nos gradientes: primers UCB 816, 820, 823, 828, 829, 836, 850, 880, 884 e 890 (46ºC); 808, 810, 812, 825, 827, 847, 849 e 855 (47ºC); 818 e 876 (48ºC); 848 (49ºC); 864, 865, 886, 887 e 889 (51ºC); 807, 830 e 888 (54ºC); 842, 856 e 866 (56ºC); 858 e 867 (59ºC). Quanto aos primers dispensados, 18 deles não amplificaram e quatro geraram apenas bandas monomórficas. Conclusão: A identificação prévia das temperaturas de anelamentos (PCR) que otimizem polimorfismos em uma população sob estudo, mostra-se como uma etapa imprescindível na otimização de tempo e insumos de Biologia Molecular.