Variabilidade do gene da proteína capsidial de três espécies virais que infectam videiras no Brasil

Abstract

RESUMOO objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade de três vírus (Rupestris stem pitting-associated virus -RSPaV, Grapevine leafroll-associated virus 2 -GLRaV-2 e Grapevine fanleaf virus -GFLV) que infectam videiras no Brasil, através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de nove isolados de RSPaV (780 pb), seis de GLRaV-2 (597 pb) e três de GFLV (1515 pb) por RT-PCR, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para cada espécie viral. Os DNAs amplificados foram clonados e sequenciados. Os isolados de RSPaV foram reunidos em quatro grupos pela análise filogenética das sequências obtidas com valores de identidade de nucleotídeos (nt) que variaram de 81 a 99%. Para GLRaV-2, dois grupos foram definidos a partir das sequências de nt, com valores de identidade que variaram de 88 a 99% e, para GFLV, foram definidos dois grupos, com valores de identidade de nt que variaram de 89 a 98%. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não-radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas. Palavras-chave: RSPaV, GLRaV-2, GFLV, RT-PCR, Vitis spp., sonda não-radioativa. ABSTRACT Coat protein gene variability of three viral species infecting grapevines in BrazilThe purpose of this study was to evaluate the variability of three viruses (Rupestris stem pitting-associated virus -RSPaV, Grapevine leafroll-associated virus 2 -GLRaV-2 and Grapevine fanleaf virus -GFLV) infecting grapevines in Brazil, through molecular characterization of the coat protein (CP) gene. DNA fragments were amplified comprising the complete CP genes of nine isolates of RSPaV (780 bp), six of GLRaV-2 (597 bp) and three of GFLV (1515 bp) by RT-PCR, using specific primers for each viral species. The amplified DNA fragments were cloned and sequenced. RSPaV isolates were clustered into four groups by phylogenetic analysis of the nucleotide (nt) sequences of the CP gene, showing identity values ranging from 81 to 99%. For GLRaV-2, two groups were defined from nt sequences, with identity values ranging from 88 to 99% and for GFLV, two groups were defined with identity values ranging from 89 to 98%. The isolates of each viral species studied here were detected by non-radioactive probes labeled with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independent of the isolate used as template for probe synthesis.

Produção de antissoro policlonal utilizando a proteína capsidial recombinante do Rupestris stem pitting-associated virus

“…O gene completo da proteína capsidial (CP) do isolado viral de RSPaV (com 780pb e 259 aminoácidos deduzidos), denominado CF207, foi previamente caracterizado por RADAELLI et al (2009). O gene da CP do RSPaV foi removido do plasmídeo pGEM-T Easy (Promega) pela digestão com a enzima de restrição EcoRI, eluído a partir de gel de agarose e, posteriormente, ligado ao vetor de expressão pRSET-B (Invitrogen), previamente digerido com EcoRI (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).…”

“…A purificação da fração IgG foi realizada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-SEPHACEL e quantificada por espectrofotometria (FAJARDO et al, 2007). A sensibilidade e a especificidade do antissoro produzido foram avaliadas em ELISA indireto (RADAELLI et al, 2008), com amostras de videiras sadias ou infectadas por 12 diferentes isolados de RSPaV dos quais oito foram previamente caracterizados molecularmente (RADAELLI et al, 2009;BASSO, 2010).…”

“…Visando avaliar a eficiência da detecção sorológica de diferentes isolados de RSPaV com o antissoro produzido contra o isolado CF207, determinou-se a percentagem de identidade de nucleotídeos do gene CP completo deste isolado em relação a oito isolados caracterizados anteriormente (RADAELLI et al, 2009;BASSO, 2010). As comparações entre sequências foram realizadas utilizando-se os programas BLASTn e BLASTp do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).…”

Detecção e identificação molecular de vírus associados a videiras sintomáticas e assintomáticas

“…As identidades de nt e aad entre os dois isolados caracterizados foram de 84,7% e 81,8%, respectivamente. ALABI et al (2010) analisaram, com base na análise filogenética do gene da proteína capsidial, 84 isolados de RSPaV, incluindo nove isolados brasileiros, caracterizados por RADAELLI et al (2009), que se agruparam com a estirpe típica "GRSPaV-1" (isolados 420A, MG, CF210, CF208, MH, CF195-2, PN e CF207) e com a estirpe "GRSPaV-BS" (isolado CF195). MENG et al (2005b) demonstraram experimentalmente que a infecção da videira cv.…”

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR

“…Considering the existence of nucleotide sequence variability among isolates, eleven GRSPaV-isolates and three GFLV-isolates, previously characterized (Radaelli et al, 2009;Basso et al, 2010), were submitted to analysis. For these analyses, purified coat protein (CP) DNA fragments (adjusted to 0.01 ng DNA/µL) from recombinant plasmids were used.…”