XIST Repression in the Absence of DNMT1 and DNMT3B

Abstract

X chromosome inactivation (XCI) in human and mice involves XIST/Xist gene expression from the inactive X (Xi) and repression from the active X (Xa). Repression of the XIST/Xist gene on the Xa has been associated with methylation of its 5' region. In mice, Dnmt1 has been shown to be involved in the methylation and transcriptional repression of Xist on Xa. We examined maintenance of XIST gene repression on Xa in HCT116 cell lines knockout for either DNMT1 or DNMT3B and for DNMT1 and DNMT3B simultaneously. Methylation of the XIST promoter and XIST transcriptional repression is sustained in DNMT1-, DNMT3B- and DNMT1/DNMT3B knockout cells. Despite global DNA demethylation, the double knockout cells present only partial demethylation of the XIST promoter, which is not sufficient for gene reactivation. In contrast, global DNA demethylation with 5-aza-2'-deoxycytidine leads to XIST expression. Therefore, in these human cells maintenance of XIST methylation is controlled differently than global genomic methylation and in the absence of both DNMT1 and DNMT3B.

Análise funcional dos genes Xist e DNMT1 na manutenção do processo de inativação do cromossomo X humano através do silenciamento gênico por RNAi

“…Mais especificamente no controle da expressão de XIST, a ausência de DNMT1 e DNMT3B não foi suficiente para modificar a metilação de seu promotor a ponto de alterar seu padrão de expressão (Vasques et al, 2005 . A linhagem estabelecida no laboratório (Vasques, 2003) (Sambrook et al, 1989).…”

“…Utilizando as células HCT116 nocautes para esses genes (Rhee et al, 2000;Rhee et al, 2002), foi observada manutenção da repressão de XIST, mesmo com uma desmetilação parcial da região 5' desse gene nas células duplo nocaute. Esses resultados demonstram que, embora causem a desmetilação global do DNA, a inativação dessas enzimas não foi suficiente para modificar o padrão de metilação de XIST a ponto de alterar seu padrão de expressão (Vasques et al, 2005), talvez pela ação residual desempenhada pelas hipoformas de DNMT1 presentes nessas células (Egger et al, 2006 (Fig. 19).…”

“…Um estudo prévio do nosso grupo avaliou alguns dinucleotídeos CpG da região 5' desse gene nas linhagens de carcinoma humano HCT116 deficientes para DNMT1, DNMT3B ou ambas (DKO, de duplo nocaute) (Rhee et al, 2000(Rhee et al, e 2002Vasques et al, 2005 Suzuki et al, 2004;Leu et al, 2003;Ting et al, 2004;Egger et al, 2006 An experimental system was optimized to study possible disturbances in maintenance of XCI, where the re-expression of genes submitted to this process could be monitored. In this system we identified two genes, MAOA and GYG2, whose pattern of expression on the Xi, differed from what had been previously described.…”

Triagem funcional de genes envolvidos no processo de manutenção da inativação do cromossomo X em humanos

“…O tratamento de células de uma linhagem de fibroblastos dérmicos primários humanos com 5-aza-2'-deoxicitidina -um potente inibidor de DNMT1 -não é suficiente para promover a reativação dos genes submetidos à XCI (Wolf & Migeon, 1982), embora em uma linhagem masculina de células transformadas esse tratamento resulte na expressão parcial de XIST a partir do único cromossomo X presente nessas células (Vasques et al, 2005). Além disso, a redução de 97% dos níveis de metilação global observada em uma linhagem de células de carcinoma embrionário duplo-knockout para DNMT1 e DNMT3 (DNA methyltransferase 3) (Rhee et al, 2002) não é suficiente para promover a expressão de XIST a partir do único cromossomo X presente.…”

Estabilidade do controle epigenético em células humanas normais e transformadas

“…Dado que em células murinas deficiência de Dnmt1 leva à expressão do gene Xist a partir do X ativo (Beard, Li et al, 1995), nosso grupo questionou como estaria o controle de XIST nas linhagens humanas nocaute para as diferentes DNMTs. Neste estudo, foi demonstrado que as células DKO mantinham a repressão de XIST no X ativo mesmo em condição de desmetilação global do genoma (Vasques, Stabellini et al, 2005), situação oposta ao observado em camundongos.…”